第一章基于病例對(duì)照及薈萃分析的NRG1多態(tài)性與先天性巨結(jié)腸癥易感性研究背景:先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung disease,HD)是腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric nervous system,ENS)發(fā)育畸形最常見的類型,其易感性與基因多態(tài)性密切相關(guān)。NRG1基因是通過全基因組關(guān)聯(lián)研究首次在中國人群發(fā)現(xiàn)的HD易感基因,其多態(tài)性位點(diǎn)rs7835688、rs16879552與HD發(fā)病密切相關(guān)。迄今為止,已有多項(xiàng)病例-對(duì)照分子流行病學(xué)研究在不同人群中對(duì)這2個(gè)位點(diǎn)與HD的易感性進(jìn)行了重復(fù)與驗(yàn)證,但結(jié)論并不一致。因此本文擬進(jìn)一步深入探討rs7835688、rs16879552多態(tài)性與HD遺傳易感性之間的關(guān)系。方法:(1):首先采用大樣本病例-對(duì)照分子流行病學(xué)關(guān)聯(lián)性分析,定點(diǎn)研究NRG1基因rs7835688、rs16879552位點(diǎn)與中國人群HD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。(2)利用公共數(shù)據(jù)庫(Pub Med、EMBASE、Web of Science)檢索已發(fā)表的文章數(shù)據(jù),結(jié)合前一步的Taq Man基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行薈萃分析,討論rs7835688、rs16879552與HD的關(guān)聯(lián)。(3)將所有的研究對(duì)象分為黃種人與白種人二個(gè)人群進(jìn)行亞組分析,探索rs7835688、rs16879552與不同種族之間的人種-基因交互作用。(4)根據(jù)HD的臨床類型,將其分為短段型、長段型/全結(jié)腸型二個(gè)亞組,探討rs7835688、rs16879552與不同臨床類型HD之間的基因-表型交互作用。結(jié)果:(1)病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)分析顯示,無論在何種遺傳模式下,rs7835688與HD的患病風(fēng)險(xiǎn)均呈正相關(guān),而rs16879552則與HD的患病風(fēng)險(xiǎn)并無關(guān)聯(lián)。(2)薈萃分析一共納入9項(xiàng)臨床研究,7項(xiàng)關(guān)于亞洲人,2項(xiàng)研究對(duì)象為白種人。所有文獻(xiàn)均采用病例-對(duì)照設(shè)計(jì),其中2篇為全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS),7篇為基因定點(diǎn)分析(Fine-mapping)。對(duì)所有文獻(xiàn)的對(duì)照組基因型分布進(jìn)行哈-溫平衡驗(yàn)證,其中5篇符合哈-溫平衡標(biāo)準(zhǔn),另外4篇由于基因型頻率數(shù)據(jù)不完整而無法計(jì)算。5項(xiàng)研究對(duì)照組來源于社區(qū)人群,4項(xiàng)研究對(duì)照組來源于醫(yī)院人群。(3)在所有遺傳模型中,rs7835688均增加HD患病風(fēng)險(xiǎn);對(duì)于rs16879552,除了顯性遺傳模型下與HD無明顯關(guān)聯(lián),其他三種遺傳模型下rs16879552等位基因C均明顯增加HD易感性。(4)基于人種的亞組分析顯示,對(duì)于rs7835688,4種遺傳模型下均與黃種人HD易感性相關(guān),而與白種人無明顯關(guān)聯(lián);對(duì)于rs16879552,在純合模型、隱性模型、等位基因模型下與黃種人HD風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān),但與白種人HD遺傳易感性無關(guān)聯(lián)。(5)基于HD臨床分型的亞組分析顯示,rs7835688在4種遺傳模型下均與短段型HD易感性相關(guān),但不增加長段型/全結(jié)腸型HD的患病風(fēng)險(xiǎn);而rs16879552僅在等位基因模型下與長段型/全結(jié)腸型HD相關(guān)。結(jié)論:NRG1基因多態(tài)性位點(diǎn)rs7835688、rs16879552可增加亞洲人群HD遺傳易感性,但與白種人HD患病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系并不確切,其潛在的生物學(xué)機(jī)制尚需更多研究去進(jìn)行探討。第二章全基因組測(cè)序篩選先天性巨結(jié)腸癥新易感基因ALK及其功能鑒定背景:先天性巨結(jié)腸癥(HD)是引起小兒功能性腸梗阻最主要的消化道畸形,屬于腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)發(fā)育異常性疾病,結(jié)腸粘膜下及肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失是該病主要的病理改變,腸神經(jīng)嵴細(xì)胞(ENCC)在ENS發(fā)育過程中遷移停滯是引起HD的內(nèi)在原因。ENCC在定植分化為腸神經(jīng)元的過程中,必須適應(yīng)不斷變化的腸道微環(huán)境,整個(gè)過程由來源于神經(jīng)嵴和腸道微環(huán)境的特定信號(hào)通路分子和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。任何編碼這些分子的基因發(fā)生突變,都有可能影響到整個(gè)ENCC的定植過程,成為HD的致病基因。目前已知的基因及其變異位點(diǎn)并不能解釋所有HD病例發(fā)病原因,因此本研究主要通過全基因組測(cè)序,系統(tǒng)繪制HD相關(guān)的基因組變異圖譜,篩選出新的易感基因。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證,探索基因突變對(duì)ENCC生物學(xué)行為的影響。方法:(1)收集13份全結(jié)腸巨結(jié)腸患兒及其父母外周血標(biāo)本,提取基因組DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序。通過生物信息學(xué)分析過濾各種遺傳變異,鑒定出與HD發(fā)病相關(guān)的顯著突變基因。(2)NCBI GEO Datasets數(shù)據(jù)庫查找突變基因ALK在人體胚胎組織的表達(dá)情況。(3)免疫組織化學(xué)技術(shù)、PCR及Western-blot檢測(cè)ALK在病變組織及正常結(jié)腸中的表達(dá)差異。(4)用攜帶ALK sh RNA的敲低載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的ENCC,通過MTT實(shí)驗(yàn)、RTCA細(xì)胞實(shí)時(shí)分析實(shí)驗(yàn)觀察該基因敲低對(duì)ENCC增殖、遷移能力的影響。結(jié)果:(1)基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了2149個(gè)突變,其中ACMG預(yù)測(cè)為有害/可能有害的突變有1927個(gè),共有突變篩選發(fā)現(xiàn)222個(gè)突變。(2)采用SIFT、Polyphen、Mutation Taster、CADD等軟件對(duì)篩選出來的位點(diǎn)進(jìn)行受累氨基酸化學(xué)性質(zhì)分析、序列保守性分析及生物信息學(xué)預(yù)測(cè),最終確定ALK為新的HD候選基因。ALK基因在2例患兒中存在突變,其中1例為純合突變:c.C1648T[p.L550F];另一個(gè)樣本中為復(fù)合雜合突變:c.C3035T[p.T1012M]與c.G487T[p.V163L]。(3)數(shù)據(jù)庫中RNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集顯示ALK于胚胎期在胃及結(jié)腸組織中的表達(dá)明顯高于其他組織。(4)ALK主要表達(dá)于腸神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)纖維,位于胞漿及細(xì)胞膜。與正常結(jié)腸組織相比,基因突變患兒狹窄段結(jié)腸ALK m RNA及蛋白表達(dá)明顯降低。(5)在ENCC細(xì)胞系中運(yùn)用sh RNA技術(shù)敲低ALK表達(dá)后細(xì)胞的增殖及遷移能力明顯降低。結(jié)論:(1)采用全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)先天性巨結(jié)腸的各類遺傳變異進(jìn)行了篩選,包括In Dels、SNV、SV及CNV等,篩選出ALK基因錯(cuò)義突變可能與HD的發(fā)病密切相關(guān)。(2)ALK與ENCC的生物學(xué)行為密切相關(guān),其表達(dá)降低可抑制ENCC的增殖與遷移能力。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R726.5
【部分圖文】：

一共有9 項(xiàng)臨床研究探討了 rs7835688 和/或 rs16879552 與 HD 的遺傳易感性。研究路線如圖1 所示。圖 1 薈萃分析技術(shù)路線圖3、納入研究基本情況9 項(xiàng)臨床研究中，7 項(xiàng)關(guān)于亞洲人[5, 12, 18-22]，2 項(xiàng)研究對(duì)象為白種人[13, 14]。所有文獻(xiàn)均采用病例-對(duì)照設(shè)計(jì)，其中 2 篇為全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），7 篇為基因定點(diǎn)分析（Fine-mapping）。我們對(duì)所有文獻(xiàn)的對(duì)照組基因型分布進(jìn)行哈-溫平衡驗(yàn)證，其中 5 篇符合哈-溫平衡標(biāo)準(zhǔn)，另外 4 篇由于基因型頻率數(shù)據(jù)不完整而無法計(jì)算。5 項(xiàng)研究對(duì)照組來源于社區(qū)人群（P-B），4 項(xiàng)研究采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對(duì)照設(shè)計(jì)（H-B）。各研究的基本特征在表 3 中具體描述。納入文獻(xiàn)的評(píng)分在 9-11 分之間

rs7835688與HD患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性

中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文檢驗(yàn)及發(fā)表偏倚（rs7835688）目遺傳模型 異質(zhì)性檢驗(yàn) 發(fā)Q P value I2(%) BegCC vs GG 20.5 3.977E-04 80.5 –CC vs CG+GG 32.62 1.430E-06 87.7 –CC+CG vs GG 9.57 4.838E-02 58.2 –C vs G 30.67 7.141E-05 77.2 0
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳爍;周春菊;馬曉莉;宮麗平;;兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤ALK基因及其表達(dá)的異常[J];中華病理學(xué)雜志;2014年08期

2 Adam S Wallace;Richard B Anderson;;Genetic interactions and modifi er genes in Hirschsprung's disease[J];World Journal of Gastroenterology;2011年45期

本文編號(hào)：2892536