目的:果聚糖可用于預(yù)防并調(diào)節(jié)多種人類的疾病,并且對(duì)人體的毒副作用完全不存在,被認(rèn)定是營(yíng)養(yǎng)型的保健食品,已被許多國(guó)家批準(zhǔn)并廣泛的用在食品、化裝品、飼料等。另外,果聚糖作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),與植物的抗逆性密切相關(guān)。因此,本研究擬通過(guò)導(dǎo)入外源果糖基轉(zhuǎn)移酶基因來(lái)提高甜菜中果聚糖含量,獲得高產(chǎn)甜菜株系,為利用高產(chǎn)植物作為生物反應(yīng)器廉價(jià)生產(chǎn)功能性多糖奠定基礎(chǔ)。方法:將洋蔥(Allium cepa)的蔗糖-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因SST(sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase,1-SST)與甜菜根部特異性啟動(dòng)子MLL重組,以p BI121為起始載體,構(gòu)建p BI121-MLL-SST,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甜菜(Beta.vulgaris)品種,STFD4,利用PCR鑒定轉(zhuǎn)化植株,并用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)SST基因的表達(dá),分別對(duì)轉(zhuǎn)基因甜菜株系和野生型甜菜的葉片相對(duì)含水量、MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率、PSII相對(duì)量子產(chǎn)率、和各糖類指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果:(1)本研究成功克隆并構(gòu)建成植物表達(dá)載體p BI121-MLL-SST。經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化進(jìn)入甜菜,通過(guò)PCR與RT-PCR鑒定,獲得轉(zhuǎn)基因甜菜。(2)建立并優(yōu)化了甜菜葉柄的再生體系。結(jié)果顯示:最佳滅菌方式是將甜菜種子破除種殼后,種子先用10%H2O2處理1min,再用0.1%升汞滅菌10 min;最適宜的葉柄分化數(shù)的培養(yǎng)基是MS+6-BA1.0 mg·m L-1+NAA 0.2 mg·m L-1;從葉柄誘導(dǎo)的不定芽獲取新的葉柄再誘導(dǎo);最佳生根培養(yǎng)基是1/2MS+NAA 1.0 mg·m L-1+IBA 0.2 mg·m L-1,生根率達(dá)到95%以上;將生根組培苗移栽,成活率高達(dá)96%。(3)利用干旱脅迫處理進(jìn)行抗旱性分析,結(jié)果表明:與對(duì)照相比,轉(zhuǎn)SST植株葉片萎蔫較遲且程度較輕;其葉片相對(duì)含水量和PSII相對(duì)量子產(chǎn)率的降低幅度、相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量的升高幅度均低于對(duì)照甜菜植株。說(shuō)明在干旱條件下,與對(duì)照之間相比,轉(zhuǎn)p BI121-MLL-SST基因的各株系更能減少植物在水中的流失,更能有效的提高活細(xì)胞中的抗氧化物酶的活性,使轉(zhuǎn)p BI121-MLL-SST基因甜菜的株系獲得更高的抗旱性;所以在根特異性表達(dá)的啟動(dòng)子MLL的驅(qū)動(dòng)下,轉(zhuǎn)化SST基因的甜菜株系的抗旱性得到進(jìn)一步的提升。(4)測(cè)定塊根中碳水化合物濃度的變化,結(jié)果表明:與對(duì)照相比,轉(zhuǎn)基因甜菜株系中碳水化合物的濃度發(fā)生了變化,其中蔗果三糖、果糖、葡萄糖濃度/mg·m L-1均高于野生型甜菜,而蔗糖濃度/mg·m L-1均低于野生型甜菜。并且果聚糖濃度的提高率在28.57%~74.34%之間。結(jié)論:利用基因工程的手段可有效地提高甜菜中低聚果糖的濃度,獲得高產(chǎn)甜菜植株,這為開(kāi)辟工業(yè)上以甜菜作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)低聚果糖奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S566.3;Q943.2
【部分圖文】：

分離并純化出果糖基轉(zhuǎn)移酶。例如：1-SST、1-FFT、6-SFT以及6G-FFT，已提出另外一種比較完整的高等植物中果聚糖不同類型的合成代謝模型（圖1-1）.該模型認(rèn)為：蔗糖通過(guò)1-SST作用生成蔗果三糖，在此基礎(chǔ)上1-FFT延伸碳鏈生成菊糖型果聚糖。6-SFT因其特性是多種催化，所以可參與到多種反應(yīng)中。6G-FFT作用于1-蔗果三糖產(chǎn)生新蔗果三糖。使其具有特異性反應(yīng)的功能。圖1-1 高等植物中生物合成果聚糖模型[46]Fig.1-1fructan model of Biosynthesis in higher plants注: 蔗糖作為合成的前體, 經(jīng)不同的果糖基轉(zhuǎn)移酶協(xié)同作用合成了不同結(jié)構(gòu)的果聚糖。2.3 果聚糖的分類在微生物中，果聚糖的單體之間主要以β-2，6-鍵相互連接。在細(xì)菌中，是以β-2，1-鍵相互連接,并且分子量極大。在植物中，果聚糖多樣化類型更加突出。目前，高等植物中發(fā)現(xiàn)的果聚糖類型有5種

66型的分布較少。它主要以β-2,6-鍵與1個(gè)或多個(gè)的果糖連接而形成(圖1-2B)。(3)線型菊糖型果聚糖新生系列(linearinulinneoseries)：主要為百合科的植物特有，如洋蔥、天門冬等。它是果糖基以線性β-2，1-鍵與蔗糖上葡萄糖分子中的兩端Cl和C6位連接而形成。此果聚糖屬于新蔗果三糖(圖1-2C)�；旌闲凸厶�(mixedlevan)：主要為禾本科植物特有，如小麥、大麥等。它是以β(2-l)和β(2-6)鍵與1個(gè)或多個(gè)的果糖基連接而組成。混合型果聚糖中最小的分子為蔗果四糖(bifureose)(圖1-2D)。(5)梯牧草糖型果聚糖新生系列(levanneoseries)：它只為少數(shù)植物所有,如燕麥。它的基本單位為新蔗果三糖。它是以β(2-6)鍵與果糖基單元連接而形成。(圖2E)。2.4 果聚糖的分子生物學(xué)研究進(jìn)展果聚糖是由蔗糖與一個(gè)或多個(gè)果糖基相連接的聚合物, 是一類重要的碳水化合物和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 可提高植物的抗逆性；果聚糖還是一類重要的功能性食品, 對(duì)人體健康有多種促進(jìn)作用。果聚糖主要是在植物由多種果糖基轉(zhuǎn)移酶參與合成，果糖基轉(zhuǎn)移酶的組合不同其產(chǎn)物果聚糖的類型也不同。2.4.1 果聚糖相關(guān)酶基因的克隆及結(jié)構(gòu)、功能的研究合成不同類型的果聚糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)特性緊密聯(lián)系。目前，隨著生物技術(shù)水平的發(fā)展，各種不同果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在陸續(xù)克隆，使探討調(diào)控果聚糖代謝的機(jī)制已不再是難題。自從在植物中成功克隆第一個(gè)和果聚糖代謝有密切聯(lián)系的果糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA 之后[47]，其他類型的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因已被成功克隆。依照已克隆的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列可推出其氨基酸序列并進(jìn)行分析

催化性質(zhì)就會(huì)不同，從而生成的產(chǎn)物也就不可能相同。想要更好的弄清不同的果糖基轉(zhuǎn)移酶之間存在的進(jìn)化關(guān)系，依照已研究確定的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因推出的氨基酸序列制作出一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（ 圖1-3），結(jié)果表明：果糖基轉(zhuǎn)移酶可分為三組類別，第 I 組是存在雙子葉植物中的菊科的果糖基轉(zhuǎn)移酶，又進(jìn)一步分為 1-SST 和 1-FFT 這兩小分支；第 II組是單子葉植物中百合科的果糖基轉(zhuǎn)移酶，又進(jìn)一步分為1-SST 和 6G-FFT 這兩小分支；第 III 組是單子葉植物中禾本科的果糖基轉(zhuǎn)移酶，關(guān)鍵是分為 1-SST 和 6-SFT這兩小分支[52]。所以，從聚類分析的角度進(jìn)一步證實(shí)：在合成果聚糖代謝中必不可少的是 1-SST，其重要作用就是把蔗糖催化成蔗果三糖。并且從聚類分析的結(jié)果看，它與合成果聚糖的代謝路徑幾乎吻合。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2888415