發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 00:10

　　 番木瓜是二倍體雙子葉草本植物,含有18條染色體,其基因組草圖已構(gòu)建完成。由于其生長(zhǎng)周期短、性別多樣及結(jié)籽多等特點(diǎn),使番木瓜成為研究植物性別決定的模式植物之一。番木瓜植株有三種性別,分別為雌性(XX)、雄性(XY)和兩性(XYh),在番木瓜產(chǎn)業(yè)化種植中多采用可自交結(jié)果的兩性植株,但是兩性植株的種子存在性別分離的現(xiàn)象,無(wú)法持續(xù)獲得兩性種子,需要采取前期過(guò)度密植、后期間苗的種植方法;此外,番木瓜果實(shí)中大量種子的存在為番木瓜產(chǎn)業(yè)化深加工帶來(lái)技術(shù)難度,造成番木瓜副加工產(chǎn)業(yè)難以成形。這兩個(gè)問(wèn)題對(duì)番木瓜的產(chǎn)業(yè)化種植和加工工業(yè)影響深刻。本研究通過(guò)對(duì)番木瓜胚胎發(fā)育過(guò)程的分析,綜合胚胎發(fā)育候選基因Cp49的功能分析,同時(shí)對(duì)番木瓜胚胎發(fā)育相關(guān)基因的突變體的篩選和鑒定,為實(shí)現(xiàn)XYh性別不分離和無(wú)籽番木瓜新種質(zhì)的創(chuàng)建提供可能,并為最終解決番木瓜商業(yè)化種植和加工的難題提供研究基礎(chǔ)。前期研究發(fā)現(xiàn)在番木瓜性別決定區(qū)域中存在一些與胚胎發(fā)育相關(guān)的基因,本研究主要對(duì)它們的表達(dá)與調(diào)控進(jìn)行研究,結(jié)果如下:1.番木瓜體細(xì)胞胚發(fā)生和轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)番木瓜體細(xì)胞胚進(jìn)行形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察,根據(jù)其不同發(fā)育階段的特點(diǎn),將番木瓜體細(xì)胞胚劃分為四個(gè)發(fā)育階段,分別為球形胚階段、心形胚階段、魚雷胚階段和子葉胚階段。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組研究分析番木瓜雌性體細(xì)胞胚和兩性體細(xì)胞胚不同發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)基因。主要分為兩個(gè)方面進(jìn)行比較:(1)分析兩種性別、同一發(fā)育時(shí)期體細(xì)胞胚中差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示,在胚胎發(fā)育的早期階段,雌性番木瓜和兩性番木瓜在基因表達(dá)上已經(jīng)出現(xiàn)明顯差異。在球形胚發(fā)育階段,差異基因主要集中在細(xì)胞壁的形成過(guò)程;而心形胚形成階段,表達(dá)差異體現(xiàn)在物質(zhì)和能量代謝通路相關(guān)基因;魚雷胚階段主要區(qū)別在核小體和染色質(zhì)的組裝過(guò)程中的相關(guān)基因;子葉胚階段差異基因主要參與細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)的形成、代謝過(guò)程以及分生組織的形成及分化。(2)分析同一性別胚胎發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)趨勢(shì)。結(jié)果顯示,心形胚階段和魚雷胚階段是番木瓜體細(xì)胞胚發(fā)育的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),分別有89%和83%的基因表達(dá)在心形胚和魚雷胚階段出現(xiàn)轉(zhuǎn)折,表現(xiàn)出明顯的上調(diào)或者下調(diào)趨勢(shì)。2.利用TILLING方法篩選胚胎發(fā)育相關(guān)基因的突變體前期試驗(yàn)結(jié)果表明,番木瓜性別決定區(qū)域的相關(guān)基因可能影響胚胎發(fā)育。利用EMS誘變劑處理番木瓜種子,構(gòu)建M1代誘變?nèi)后w,通過(guò)高通量測(cè)序篩選突變體,并通過(guò)PCR測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證,共發(fā)現(xiàn)三株陽(yáng)性突變體植株,其分別為cpxyh3、emb506和pxcpxyh14基因的錯(cuò)義突變體。3.番木瓜胚胎發(fā)育候選基因Cp49的時(shí)空表達(dá)模式為了探究Cp49基因的表達(dá)模式,利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)Cp49基因的組織表達(dá)特異性分析,結(jié)果顯示其在體細(xì)胞胚發(fā)育的球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚階段均有表達(dá),且表達(dá)量逐漸降低,Cp49基因在球形胚時(shí)期表達(dá)量最高,子葉胚時(shí)期表達(dá)量最低。4.番木瓜Cp49互補(bǔ)擬南芥同源基因emb976突變體通過(guò)構(gòu)建番木瓜Cp49的基因進(jìn)化樹,找到其親緣關(guān)系最近的同源基因EMB976。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),擬南芥emb976的T-DNA插入雜合突變體子葉胚時(shí)期表現(xiàn)出部分胚胎敗育,敗育率約為25%。為了探究番木瓜Cp49與擬南芥同源基因在功能上是否保守,構(gòu)建擬南芥EMB976自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cp49全長(zhǎng)CDS的表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵花轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化擬南芥突變體emb976,結(jié)果發(fā)現(xiàn)番木瓜Cp49基因異源表達(dá)可部分恢復(fù)擬南芥emb976的胚胎敗育的表型,說(shuō)明Cp49和EMB976基因功能具有一定的保守性。5.番木瓜轉(zhuǎn)基因研究為了進(jìn)一步探究番木瓜Cp49的功能,我們構(gòu)建了番木瓜Cp49-X-CRISPR/Cas9 基因編輯載體、Cp49-XYh-CRISPR/Cas9 基因編輯載體和Cp49-XYh-RNAi載體,通過(guò)農(nóng)桿菌侵染法將它們分別轉(zhuǎn)化番木瓜愈傷組織,經(jīng)過(guò)篩選目前已得到Cp49-XYh-CRISPR/Cas9潮霉素抗性篩選植株和Cp49-XYh-RNAi潮霉素抗性篩選的愈傷組織,為下一步深入研究Cp49基因的功能提供了實(shí)驗(yàn)材料。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S667.9
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 綜述
    1.1 番木瓜概述
    1.2 胚胎發(fā)育相關(guān)研究進(jìn)展
        1.2.1 胚胎發(fā)育的過(guò)程
        1.2.2 胚胎發(fā)育相關(guān)基因的研究
        1.2.3 EMB976基因的相關(guān)研究
    1.3 體細(xì)胞胚發(fā)育的相關(guān)研究
    1.4 TILLING技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用
        1.4.1 TILLING技術(shù)概述
        1.4.2 TILLING技術(shù)發(fā)展
        1.4.3 TILLING技術(shù)的流程
        1.4.4 TILLING技術(shù)的應(yīng)用
    1.5 本研究的研究目的和意義
        1.5.1 番木瓜產(chǎn)業(yè)化種植的便利性
        1.5.2 為無(wú)籽番木瓜培育奠定基礎(chǔ)
第二章 番木瓜體細(xì)胞胚發(fā)生的形態(tài)學(xué)、組織細(xì)胞學(xué)觀察及轉(zhuǎn)錄組分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 儀器與試劑
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)
        2.3.2 胚性愈傷組織的性別鑒定
        2.3.3 體細(xì)胞胚發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察
        2.3.4 體細(xì)胞胚發(fā)育的組織學(xué)觀察
        2.3.5 體細(xì)胞胚的轉(zhuǎn)錄組分析
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 番木瓜體細(xì)胞胚性別鑒定
        2.4.2 番木瓜體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程觀察
        2.4.3 番木瓜體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程組織學(xué)觀察
        2.4.4 轉(zhuǎn)錄組分析
    2.5 討論
第三章 TILLING篩選番木瓜胚胎發(fā)育相關(guān)基因突變體
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
    3.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 EMS誘變處理
        3.3.2 幼苗移栽
        3.3.3 基因組DNA提取
        3.3.4 目的片段擴(kuò)增
        3.3.5 DNA建庫(kù)
        3.3.6 文庫(kù)測(cè)序
        3.3.7 數(shù)據(jù)分析
        3.3.8 初步驗(yàn)證
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.5 討論
第四章 Cp49基因在擬南芥同源基因突變體中的表達(dá)與恢復(fù)
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
    4.2 儀器與試劑
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 物種基因進(jìn)化樹構(gòu)建
        4.3.2 恢復(fù)載體構(gòu)建
        4.3.3 擬南芥突變體表型鑒定
        4.3.4 浸花轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化擬南芥突變體植株
        4.3.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建
        4.4.2 擬南芥恢復(fù)載體構(gòu)建
        4.4.3 擬南芥突變體鑒定
        4.4.4 恢復(fù)載體轉(zhuǎn)化苗的鑒定與表型觀察
    4.5 討論
第五章 Cp49基因在番木瓜中的敲除和沉默表達(dá)
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
    5.2 儀器與試劑
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
h基因編輯載體的構(gòu)建'>        5.3.1 番木瓜Cp49-XY^h基因編輯載體的構(gòu)建
        5.3.2 番木瓜Cp49-X基因編輯載體的構(gòu)建
        5.3.3 番木瓜RNAi載體構(gòu)建
        5.3.4 番木瓜Cp49基因在體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)
        5.3.5 番木瓜愈傷誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)化
    5.4 結(jié)果及分析
        5.4.1 載體構(gòu)建驗(yàn)證
        5.4.2 Cp49基因在體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)
        5.4.3 番木瓜愈傷組織的誘導(dǎo)
        5.4.4 番木瓜遺傳轉(zhuǎn)化
    5.5 討論
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝

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