芒果是我國(guó)極具特色的熱帶水果,素有“熱帶果王”之美稱(chēng)。色澤是果實(shí)外觀品質(zhì)中的核心指標(biāo),其對(duì)果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要作用。色素的積累是果實(shí)色澤形成的物質(zhì)基礎(chǔ),色素的種類(lèi)和含量決定了果實(shí)的色質(zhì)和呈色深度。果實(shí)的呈色素主要包括葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、花青苷和黃酮類(lèi)等物質(zhì)。其中類(lèi)胡蘿卜素在芒果果實(shí)中的分布十分廣泛,并隨種類(lèi)不同,呈現(xiàn)無(wú)色、淺黃色、黃色、橙色到紅色不等,而其所含的主要類(lèi)胡蘿卜種類(lèi)和含量尚不清楚,研究利用高效液相色譜法檢測(cè)‘紅玉’芒果和‘桂熱82號(hào)’芒果2個(gè)品種成熟果實(shí)的果皮中的主要類(lèi)胡蘿卜種類(lèi)和含量。以‘紅玉’芒果為試驗(yàn)材料,開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,篩選鑒定了部分與類(lèi)胡蘿卜素相關(guān)的基因片段,并以類(lèi)蘿卜素代謝為基礎(chǔ)克隆了部分重要基因,開(kāi)展了生物信息學(xué)分析,同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)進(jìn)行初步鑒定,為闡明芒果果皮類(lèi)胡蘿卜素合成和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ),本研究的研究結(jié)果如下:1、利用高效液相色譜法檢測(cè)‘紅玉’芒果和‘桂熱82號(hào)’芒果2個(gè)品種成熟果實(shí)的果皮中的主要類(lèi)胡蘿卜種類(lèi)和含量,以正己烷,二氯甲烷等多種有機(jī)溶劑提取果皮的類(lèi)胡蘿卜素,使用高效液相色譜法進(jìn)行定性定量分析,結(jié)果表明‘紅玉'芒果和‘桂熱82號(hào)’芒果的成熟果實(shí)均積累葉黃素和β-胡蘿卜素,而品種間的積累量存在差異,不同成熟階段的積累量也存在差異�！t玉’芒果在采后Oh階段中含122.70 μg/g的β-胡蘿卜素,是采后6個(gè)成熟時(shí)間段中的最高含量,葉黃素在采后Oh階段的含量為最高,其含量為5.20μg/g,是其他階段的1.7倍左右�！馃�82號(hào)’芒果采后48h含量達(dá)到最大值,其含量為100.00 μg/g,葉黃素含量保持在3.30μg/g左右基本不變。2種芒果的葉黃素含量變化不大,并且β-胡蘿卜素含量均高于葉黃素的含量,其中紅玉芒果的β-胡蘿卜素含量隨著果實(shí)成熟和果皮變黃呈現(xiàn)下降趨勢(shì),但桂熱82號(hào)’芒果的β-胡蘿卜素含量則呈現(xiàn)小幅度上升,所以β-胡蘿卜素的降解是芒果果皮從綠色變成黃色的原因之一,芒果中高積累β-胡蘿卜素,為以后研究芒果積累β-胡蘿卜素的分子機(jī)理提供理想的研究材料。2、選用‘紅玉’芒果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,結(jié)果共獲得原始數(shù)據(jù)6.80Gb,通過(guò)拼接獲得了 58058個(gè)isogenes,共包含66965683 bp,平均長(zhǎng)度為1153.43bp,共鑒定得到26871個(gè)Unigene。采用GO功能分類(lèi)工具可將序列劃分為3個(gè)大類(lèi)55個(gè)亞類(lèi),共涉及到代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)等諸多生理生化過(guò)程。通過(guò)KEGG pathway分析,芒果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有27667個(gè)Unigene能注釋到296類(lèi)代謝途徑中,包括維生素消化吸收、細(xì)胞受體信號(hào)途徑代謝通路等代謝通路,共有45個(gè)Unigene注釋到類(lèi)胡蘿卜素生物合成通路上,鑒定后獲得32個(gè)類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)基因。所以對(duì)芒果后熟過(guò)程的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究,揭示了芒果后熟轉(zhuǎn)錄組的整體表達(dá)特征,獲得了芒果轉(zhuǎn)錄組unigene序列和芒果后熟過(guò)程中有重要功能的基因序列。為深入研究芒果分子標(biāo)記等研究提供數(shù)據(jù)資源。3、利用RT-PCR克隆7個(gè)與芒果合成類(lèi)胡蘿卜素相關(guān)的基因全長(zhǎng)序列,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)以上7個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明:LCYB、ZDS、CCD、PSY、PDS、BCH、VDE基因的 DNA 全長(zhǎng)分別為:1693bp、1883bp、1900bp、1620bp、1822bp、1061bp、1446bp;ORF finder分別為:1506 bp、1710bp、1614bp、1299bp、1170bp、888bp、1446bp;氨基酸數(shù)量分別為:501個(gè)氨基酸、569個(gè)氨基酸、537個(gè)氨基酸、432個(gè)氨基酸、389個(gè)氨基酸、295個(gè)氨基酸、481個(gè)氨基酸。同源性比較表明芒果中的LCYB、ZDS、CCD、PSY、PDS、BCH、VDE編碼的蛋白質(zhì)在進(jìn)化中各自都具有高度的保守性。氨基酸理化性質(zhì)的分析顯示LCYB、ZDS、CCD、PSY、PDS各自編碼的蛋白中亮氨酸(Leu)的含量雖有差別但皆是含量最高的氨基酸,但VDE則是谷氨酸(Glu)的含量最高,而B(niǎo)CH是丙氨酸(Ala)的含量最高。氨基酸疏水性/親水性的分析顯示以上基因編碼的蛋白都為親水性蛋白�？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)與分析顯示LCYB、ZDS、CCD、PSY、PDS、VDE肽鏈都位于膜外,皆不存在跨膜結(jié)構(gòu)域,說(shuō)明植物L(fēng)CYB、ZDS、CCD、PSY、PDS、VDE蛋白在質(zhì)體中完成了合成、翻譯、加工成為成熟的蛋白質(zhì)的整個(gè)過(guò)程,并沒(méi)有出入細(xì)胞器,但是BCH蛋白存在4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,1-90位的氨基酸位于膜內(nèi),91-295氨基酸之間形成4個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū),表明BCH蛋白可能是一個(gè)與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明,'桂熱82號(hào)'芒果和‘紅玉’芒果的6個(gè)時(shí)間段類(lèi)胡蘿卜素的合成限速酶PSY均是上調(diào)表達(dá)的現(xiàn)象,‘紅玉’芒果PSY基因表達(dá)量都顯著高于‘桂熱82號(hào)’芒果,同時(shí)類(lèi)胡蘿卜素的合成途徑的相關(guān)基因LCYB、ZDS、PDS、BCH、VDE初始狀態(tài)也是呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá),之后有小幅度變化。因此,從‘紅玉’芒果的果皮中克隆得到與類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)的基因,這些基因可能參與調(diào)控芒果果皮類(lèi)胡蘿卜素合成從而影響果皮在后熟過(guò)程中的顏色變化,其中PSY基因與果皮從綠色變成黃色有很大的關(guān)系。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S667.7
【部分圖文】：

?Ｖｒｉａｌ？ｘ４Ｍｈｉ＜ｉ??ｃａｎｉｈａｆｉｘａｉｔｉｃｌｕｒｉ??圖１」類(lèi)胡蘿卜素分子結(jié)構(gòu)（李福枝，２００７）??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｃｏｍｍｏｎ?ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．??１．２類(lèi)胡蘿卜素的性質(zhì)??類(lèi)胡蘿卜素是一類(lèi)脂溶性色素和大分子量的化合物，因?yàn)槠浜辛u基、甲氧??基、環(huán)氧化、羰基、結(jié)構(gòu)，所以極性較強(qiáng)，有較強(qiáng)親脂性，幾乎不溶解于水中，??易溶于有機(jī)溶劑如：石油醚、己烷、丙酮、三氯甲烷、乙醚等。但是隨著含氧官??能團(tuán)數(shù)量的增加，類(lèi)胡蘿卜素親脂性的能力則減弱，反而在乙醇中的溶解度增強(qiáng)??（惠伯棣，２００５）。??在色素細(xì)胞中，類(lèi)胡蘿卜素這類(lèi)脂溶性物質(zhì)是膜蛋白不可或缺的一部分，類(lèi)??胡蘿卜素具有不穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)，在遇氧、遇酸、強(qiáng)光照、高溫下易降解變化或??異構(gòu)化，故其在生物體中將與結(jié)合蛋白綁定在一起，以達(dá)到可以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)的目??的

海南大學(xué)碩士學(xué)位論文??２材料與方法??２．１材料??２．１．１實(shí)驗(yàn)材料??（１）紅玉芒：后熟過(guò)程中，果皮由綠色逐漸轉(zhuǎn)變成黃色??（２）桂熱８２號(hào)：后熟過(guò)程中，果皮始終為綠色??本研宄所用試材均取自農(nóng)業(yè)部儋州芒果種質(zhì)資源圃，各取‘紅玉’芒、‘桂熱??８２號(hào)’芒１２個(gè)均勻一致的果，分成４組，３個(gè)果為一生物學(xué)重復(fù)，取果皮分裝，??其中每個(gè)小包裝果皮５ｇ左右，液氮速凍１０分鐘，－８０度保存。間隔２４ｈ取樣１??次，共取樣６次，直至芒果完全后熟達(dá)到可食程度。???

圖２．２紅玉芒的６個(gè)階段??Ｆｉｇ．?２．２?Ｔｈｅ?ｓｉｘ?ｓｔａｇｅｓ?ｏｆ?Ｈｏｎｇｙｕ?ｍａｎｇｏ．??２．１．２試劑及儀器設(shè)備??（１）菌株與載體??大腸桿菌感受態(tài)ＤＨ５ａ、克隆載體ｐＭＤ１９－ＴＶｅｃｔｏｒ均購(gòu)自寶生物工程（大連）??有限公司。??（２）主要試劑??ＲＮＡ提取試劑盒：多糖多酚植物總ＲＮＡ提取試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限??公司。??反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自?Ｔｈｅｒｍｏ?公司：ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ?Ｆｉｓｔ?ｓｔｒａｎｄ?ＣＤＮＡ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｋｉｔ，??目錄號(hào)：Ｋ１６２２。??反轉(zhuǎn)錄試劑盒：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ?ＲＴ?ｒｅａｇｅｎｔ?Ｋｉｔ?ｗｉｔｈ?ｇＤＮＡ?Ｅｒａｓｅｒ（Ｐｅｒｆｅｃｔ?Ｒｅａｌ??Ｔｉｍｅ），?ＴａＫａＲａ。??聚合酶購(gòu)自Ｔａｋａｒａ公司：ＥｘＴａｑ，目錄號(hào)：ＲＲ００１〇??
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本文編號(hào)：2884040