滯育(Diapause)是昆蟲(chóng)受到外界環(huán)境條件的刺激,通過(guò)穩(wěn)定的遺傳方式進(jìn)行的一種預(yù)定靜止的休眠方式,對(duì)昆蟲(chóng)應(yīng)對(duì)不良環(huán)境,保障種群及個(gè)體生存有著重要的意義。柞蠶Antheraea pernyi是以蛹滯育的完全變態(tài)昆蟲(chóng),具有較高的營(yíng)養(yǎng)、藥用及紡織價(jià)值。因地理環(huán)境的不同而致使化性發(fā)生變化,分為一化性和二化性。柞蠶蛹的滯育有利于種繭保存,而滯育的解除控制著柞蠶生產(chǎn)的起始,因此柞蠶滯育解除機(jī)制的研究不僅對(duì)于柞蠶生產(chǎn)具有著十分重要的意義,而且對(duì)于闡明蛹滯育昆蟲(chóng)滯育機(jī)制也具有重要意義,并為防治蛹滯育昆蟲(chóng)提供新的思路。本研究以柞蠶為材料,采用分子生物學(xué)的研究方法,研究了柞蠶滯育激素調(diào)控中的蛻皮激素受體基因、超氣門(mén)結(jié)合蛋白基因以及糖代謝調(diào)控中的己糖激酶基因在解除滯育及發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用,結(jié)果如下:1.柞蠶蛻皮激素受體和超氣門(mén)結(jié)合蛋白基因的克隆及表達(dá)研究根據(jù)柞蠶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)引物,克隆了柞蠶蛻皮激素受體和超氣門(mén)結(jié)合蛋白基因,分別命名為ApEcRB1(GenBanK登錄號(hào):KY411159)和ApUSP1(GenBank登錄號(hào):KY411160)。2個(gè)基因的ORF序列全長(zhǎng)分別為1 758 bp、1 401 bp,編碼585個(gè)、466個(gè)氨基酸。半定量RT-PCR檢測(cè)這2個(gè)基因在精/卵巢、絲腺和脂肪體等組織中表達(dá),其中在絲腺和脂肪體中表達(dá)量較高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析2個(gè)基因在幼蟲(chóng)蛻皮前及化蛹前后呈現(xiàn)大幅度上調(diào)表達(dá)的規(guī)律。注射20-羥基蛻皮甾酮(20E)誘導(dǎo)啟動(dòng)滯育蛹發(fā)育,結(jié)果滯育蛹誘導(dǎo)組經(jīng)過(guò)17 d羽化,比對(duì)照組滯育蛹提早羽化。滯育蛹中2個(gè)基因的表達(dá)量在注射20E后均明顯下降,其中ApEcRB1在蛹發(fā)育后期的12 d內(nèi)一直處于較低水平,但羽化前期其表達(dá)量急劇上升,蛹發(fā)育16 d(羽化前1 d)達(dá)到最高;ApUSP1基因的表達(dá)量從注射后8 d開(kāi)始升高,至16 d時(shí)達(dá)到最高。以上結(jié)果表明蛻皮激素能夠通過(guò)介導(dǎo)昆蟲(chóng)蛻皮激素受體和超氣門(mén)結(jié)合蛋白基因的表達(dá)變化來(lái)控制柞蠶的生長(zhǎng)、發(fā)育、變態(tài)。2.柞蠶滯育蛹解除滯育過(guò)程中己糖激酶基因的克隆及表達(dá)研究昆蟲(chóng)能夠?qū)⑾盏钠咸烟窃谥倔w中轉(zhuǎn)化為海藻糖或作為糖原儲(chǔ)存,當(dāng)機(jī)體需要能量時(shí),海藻糖再轉(zhuǎn)化為葡萄糖進(jìn)入糖酵解途徑,己糖激酶(hexokinase,HK)在此轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著重要的作用。為研究柞蠶蛹解除滯育及發(fā)育過(guò)程中的糖類代謝規(guī)律,克隆了柞蠶2個(gè)己糖激酶同工酶基因,分別命名為ApHK1和ApHK2(GenBank登錄號(hào):KY624592,KY624593)。2個(gè)基因的ORF全長(zhǎng)分別為1 455 bp、1 362 bp,編碼484個(gè)、453個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)柞蠶HK1和HK2蛋白分布于2個(gè)不同的進(jìn)化分支上,不同種類昆蟲(chóng)的同一類型的HK具有更高的同源性。柞蠶5齡幼蟲(chóng)各組織中,2個(gè)HK基因在脂肪體中的表達(dá)水平都較高,ApHK2在各組織中均有表達(dá),分布比ApHK1更廣,且在中腸、肌肉內(nèi)也有較高表達(dá)。以一化性柞蠶滯育蛹脂肪體組織為材料,采用qRT-PCR分析長(zhǎng)光照(17 h/d)處理柞蠶蛹滯育解除及發(fā)育過(guò)程中HK基因的表達(dá)規(guī)律,結(jié)果表明:2個(gè)HK基因的表達(dá)量在處理后21 d明顯升高,其中ApHK2的表達(dá)量升高了3.1倍;化蛹后42 d,ApHK1的表達(dá)量升高了2.8倍,而ApHK2的表達(dá)量無(wú)顯著變化。以上研究結(jié)果表明ApHK1和ApHK2在柞蠶光照解除滯育及發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,并且2個(gè)基因的調(diào)控功能因組織糖代謝途徑的不同而有所不同。3.柞蠶滯育解除過(guò)程中己糖激酶活性及葡萄糖含量變化研究采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定了柞蠶蛹滯育及滯育解除過(guò)程中葡萄糖含量及酶活性變化,結(jié)果表明蛹脂肪體中己糖激酶的活性在長(zhǎng)光照處理下高于對(duì)照組,前期呈現(xiàn)上升趨勢(shì),處理后28 d達(dá)到最高值,此后逐漸下降并于處理后35 d趨于穩(wěn)定,而蛹血淋巴中葡萄糖含量呈先下降后上升的趨勢(shì),這與脂肪體中己糖激酶的活性具有相關(guān)性。研究結(jié)果顯示在蛹發(fā)育中期己糖激酶酶活力及葡萄糖含量之間呈現(xiàn)出互補(bǔ)關(guān)系,即己糖激酶的活性增強(qiáng),血淋巴中葡萄糖的含量減少。
【學(xué)位單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S885.1
【部分圖文】：

DL2000 molecular marker，1—EcR，蠶 EcRB1 和 USP1 基因 PCR 產(chǎn)物的R amplification product of ApEcRB1 a為 1 758 bp，編碼 585 個(gè)氨基酸，無(wú)跨膜區(qū)。預(yù)測(cè) ApEcR 蛋白ding Domains, DBD）、配體結(jié)合淺灰色部分）在 183~273 aa 之與已有的 EcR 蛋白結(jié)構(gòu)域相似TTCAGTGCGAGGAAAAAGTGAAGTGAAAGTCTGCATTGGAG S V R G K S E V K V C I G CCGCTGGTCCAACAACGGATATTTCCCTCATCCTCTGCGAA R W S N N G Y F P H P L R GATGGTTATGTCACCAGAGTCACTCGCCTCGCCCGAGTATG M V M S P E S L A S P E Y GCTGGGCACCTGCAATATGCAGCAACAAGAACAGCAGCAAC L G T C N M Q Q Q E Q Q Q TAAGTCAGAAAACGAATCTATGTCTTCAGGTCGAGAGGAAC K S E N E S M S S G R E E GAAAGGGCCCACGCCTCGTCAACAAGAAGAATTGTGCCTCG

圖3-2 qRT-PCR溶解曲線Fig. 3-2 The melting curve of qRT-PCR.3 幼蟲(chóng)蛻皮及化蛹過(guò)程 ApEcRB1 和 ApUSP1 的表達(dá)變化采用qRT-PCR檢測(cè)柞蠶不同發(fā)育階段脂肪體中ApEcRB1和ApUSP1的相對(duì)表達(dá)量（圖3）。在幼蟲(chóng)期的蛻皮階段，ApEcRB1的表達(dá)量變化較大，蛻皮期間的表達(dá)量大幅上升，高升高了近6 倍，化蛹期也呈現(xiàn)出類似的規(guī)律。與ApEcRB1相比較，ApUSP1基因的達(dá)相對(duì)較高，在發(fā)育期的表達(dá)變化規(guī)律與ApEcRB1類似，但表達(dá)量變化幅度相對(duì)較低，基因的表達(dá)除5 齡早期相對(duì)較高外，幼蟲(chóng)期的表達(dá)量略低于變態(tài)發(fā)育階段，化蛹期達(dá)最高。468ApEcRB1ApUSP1a1b1b1b2a2a2表達(dá)量xpressionlevel

29顯著下降并在一段時(shí)間內(nèi)趨于穩(wěn)定直至6 h，在12 h時(shí)其表達(dá)量極顯著下降并在之后的12h內(nèi)保持穩(wěn)定（圖3-5-B）。圖3-5 蛻皮激素短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)滯育蛹ApEcRB1（A）和ApUSP1（B）的表達(dá)變化Fig. 3-5 ApEcRB1 (A) and ApUSP1 (B) expressional variations during A. pernyi diapause larvae inducedby ecdysone in a short period
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本文編號(hào)：2883721