滯育(Diapause)是昆蟲受到外界環(huán)境條件的刺激,通過穩(wěn)定的遺傳方式進(jìn)行的一種預(yù)定靜止的休眠方式,對昆蟲應(yīng)對不良環(huán)境,保障種群及個體生存有著重要的意義。柞蠶Antheraea pernyi是以蛹滯育的完全變態(tài)昆蟲,具有較高的營養(yǎng)、藥用及紡織價值。因地理環(huán)境的不同而致使化性發(fā)生變化,分為一化性和二化性。柞蠶蛹的滯育有利于種繭保存,而滯育的解除控制著柞蠶生產(chǎn)的起始,因此柞蠶滯育解除機(jī)制的研究不僅對于柞蠶生產(chǎn)具有著十分重要的意義,而且對于闡明蛹滯育昆蟲滯育機(jī)制也具有重要意義,并為防治蛹滯育昆蟲提供新的思路。本研究以柞蠶為材料,采用分子生物學(xué)的研究方法,研究了柞蠶滯育激素調(diào)控中的蛻皮激素受體基因、超氣門結(jié)合蛋白基因以及糖代謝調(diào)控中的己糖激酶基因在解除滯育及發(fā)育過程中發(fā)揮的作用,結(jié)果如下:1.柞蠶蛻皮激素受體和超氣門結(jié)合蛋白基因的克隆及表達(dá)研究根據(jù)柞蠶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物,克隆了柞蠶蛻皮激素受體和超氣門結(jié)合蛋白基因,分別命名為ApEcRB1(GenBanK登錄號:KY411159)和ApUSP1(GenBank登錄號:KY411160)。2個基因的ORF序列全長分別為1 758 bp、1 401 bp,編碼585個、466個氨基酸。半定量RT-PCR檢測這2個基因在精/卵巢、絲腺和脂肪體等組織中表達(dá),其中在絲腺和脂肪體中表達(dá)量較高。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析2個基因在幼蟲蛻皮前及化蛹前后呈現(xiàn)大幅度上調(diào)表達(dá)的規(guī)律。注射20-羥基蛻皮甾酮(20E)誘導(dǎo)啟動滯育蛹發(fā)育,結(jié)果滯育蛹誘導(dǎo)組經(jīng)過17 d羽化,比對照組滯育蛹提早羽化。滯育蛹中2個基因的表達(dá)量在注射20E后均明顯下降,其中ApEcRB1在蛹發(fā)育后期的12 d內(nèi)一直處于較低水平,但羽化前期其表達(dá)量急劇上升,蛹發(fā)育16 d(羽化前1 d)達(dá)到最高;ApUSP1基因的表達(dá)量從注射后8 d開始升高,至16 d時達(dá)到最高。以上結(jié)果表明蛻皮激素能夠通過介導(dǎo)昆蟲蛻皮激素受體和超氣門結(jié)合蛋白基因的表達(dá)變化來控制柞蠶的生長、發(fā)育、變態(tài)。2.柞蠶滯育蛹解除滯育過程中己糖激酶基因的克隆及表達(dá)研究昆蟲能夠?qū)⑾盏钠咸烟窃谥倔w中轉(zhuǎn)化為海藻糖或作為糖原儲存,當(dāng)機(jī)體需要能量時,海藻糖再轉(zhuǎn)化為葡萄糖進(jìn)入糖酵解途徑,己糖激酶(hexokinase,HK)在此轉(zhuǎn)化過程中起著重要的作用。為研究柞蠶蛹解除滯育及發(fā)育過程中的糖類代謝規(guī)律,克隆了柞蠶2個己糖激酶同工酶基因,分別命名為ApHK1和ApHK2(GenBank登錄號:KY624592,KY624593)。2個基因的ORF全長分別為1 455 bp、1 362 bp,編碼484個、453個氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)柞蠶HK1和HK2蛋白分布于2個不同的進(jìn)化分支上,不同種類昆蟲的同一類型的HK具有更高的同源性。柞蠶5齡幼蟲各組織中,2個HK基因在脂肪體中的表達(dá)水平都較高,ApHK2在各組織中均有表達(dá),分布比ApHK1更廣,且在中腸、肌肉內(nèi)也有較高表達(dá)。以一化性柞蠶滯育蛹脂肪體組織為材料,采用qRT-PCR分析長光照(17 h/d)處理柞蠶蛹滯育解除及發(fā)育過程中HK基因的表達(dá)規(guī)律,結(jié)果表明:2個HK基因的表達(dá)量在處理后21 d明顯升高,其中ApHK2的表達(dá)量升高了3.1倍;化蛹后42 d,ApHK1的表達(dá)量升高了2.8倍,而ApHK2的表達(dá)量無顯著變化。以上研究結(jié)果表明ApHK1和ApHK2在柞蠶光照解除滯育及發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用,并且2個基因的調(diào)控功能因組織糖代謝途徑的不同而有所不同。3.柞蠶滯育解除過程中己糖激酶活性及葡萄糖含量變化研究采用紫外分光光度計法測定了柞蠶蛹滯育及滯育解除過程中葡萄糖含量及酶活性變化,結(jié)果表明蛹脂肪體中己糖激酶的活性在長光照處理下高于對照組,前期呈現(xiàn)上升趨勢,處理后28 d達(dá)到最高值,此后逐漸下降并于處理后35 d趨于穩(wěn)定,而蛹血淋巴中葡萄糖含量呈先下降后上升的趨勢,這與脂肪體中己糖激酶的活性具有相關(guān)性。研究結(jié)果顯示在蛹發(fā)育中期己糖激酶酶活力及葡萄糖含量之間呈現(xiàn)出互補(bǔ)關(guān)系,即己糖激酶的活性增強(qiáng),血淋巴中葡萄糖的含量減少。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S885.1
【部分圖文】：

DL2000 molecular marker，1—EcR，蠶 EcRB1 和 USP1 基因 PCR 產(chǎn)物的R amplification product of ApEcRB1 a為 1 758 bp，編碼 585 個氨基酸，無跨膜區(qū)。預(yù)測 ApEcR 蛋白ding Domains, DBD）、配體結(jié)合淺灰色部分）在 183~273 aa 之與已有的 EcR 蛋白結(jié)構(gòu)域相似TTCAGTGCGAGGAAAAAGTGAAGTGAAAGTCTGCATTGGAG S V R G K S E V K V C I G CCGCTGGTCCAACAACGGATATTTCCCTCATCCTCTGCGAA R W S N N G Y F P H P L R GATGGTTATGTCACCAGAGTCACTCGCCTCGCCCGAGTATG M V M S P E S L A S P E Y GCTGGGCACCTGCAATATGCAGCAACAAGAACAGCAGCAAC L G T C N M Q Q Q E Q Q Q TAAGTCAGAAAACGAATCTATGTCTTCAGGTCGAGAGGAAC K S E N E S M S S G R E E GAAAGGGCCCACGCCTCGTCAACAAGAAGAATTGTGCCTCG

圖3-2 qRT-PCR溶解曲線Fig. 3-2 The melting curve of qRT-PCR.3 幼蟲蛻皮及化蛹過程 ApEcRB1 和 ApUSP1 的表達(dá)變化采用qRT-PCR檢測柞蠶不同發(fā)育階段脂肪體中ApEcRB1和ApUSP1的相對表達(dá)量（圖3）。在幼蟲期的蛻皮階段，ApEcRB1的表達(dá)量變化較大，蛻皮期間的表達(dá)量大幅上升，高升高了近6 倍，化蛹期也呈現(xiàn)出類似的規(guī)律。與ApEcRB1相比較，ApUSP1基因的達(dá)相對較高，在發(fā)育期的表達(dá)變化規(guī)律與ApEcRB1類似，但表達(dá)量變化幅度相對較低，基因的表達(dá)除5 齡早期相對較高外，幼蟲期的表達(dá)量略低于變態(tài)發(fā)育階段，化蛹期達(dá)最高。468ApEcRB1ApUSP1a1b1b1b2a2a2表達(dá)量xpressionlevel

29顯著下降并在一段時間內(nèi)趨于穩(wěn)定直至6 h，在12 h時其表達(dá)量極顯著下降并在之后的12h內(nèi)保持穩(wěn)定（圖3-5-B）。圖3-5 蛻皮激素短時間內(nèi)誘導(dǎo)滯育蛹ApEcRB1（A）和ApUSP1（B）的表達(dá)變化Fig. 3-5 ApEcRB1 (A) and ApUSP1 (B) expressional variations during A. pernyi diapause larvae inducedby ecdysone in a short period
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本文編號：2883721