本文關(guān)鍵詞：提高菜心真空滲入轉(zhuǎn)基因效率的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：真空滲入作為植物原位轉(zhuǎn)化的一種方法,是白菜類作物中迄今為止所用得最多的不依賴于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法。真空滲入轉(zhuǎn)基因方法在白菜類作物上的應(yīng)用研究雖然已有較多相關(guān)報(bào)道,但仍存在一些問題。一方面,真空滲入轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定且普遍較低。另一方面,真空度、滲入時(shí)間、植物發(fā)育時(shí)期、農(nóng)桿菌濃度、滲入介質(zhì)的表面活性劑與蔗糖含量等條件以及各因素之間的共同作用對(duì)植物轉(zhuǎn)化率影響程度尚不明確,使得真空滲入轉(zhuǎn)化技術(shù)難以進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用范圍。本研究以‘油青四九’菜心(Brassica campastris ssp. chinensis var.parachinensis'Youqing 49')為轉(zhuǎn)基因受體材料,以攜帶有pCAMBIA1301載體的GV3101農(nóng)桿菌為供體材料,針對(duì)農(nóng)桿菌菌液OD600、植株發(fā)育時(shí)期、壓強(qiáng)與時(shí)間、表面活性劑Silwet L-77的濃度及蔗糖濃度對(duì)‘油青四九’真空滲入轉(zhuǎn)化率的影響進(jìn)行了單因素研究,分析各因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。隨后對(duì)菌液OD600、壓強(qiáng)與時(shí)間、表面活性劑Silwet L-77的濃度及蔗糖濃度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),確定菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的最佳體系。此外,通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株上下部收種和雜交授粉實(shí)驗(yàn)分析原位轉(zhuǎn)化在花序中發(fā)生頻率較高的部位與時(shí)間。得到的主要結(jié)果如下：(1)對(duì)處于三種不同發(fā)育時(shí)期的菜心進(jìn)行真空滲入轉(zhuǎn)化,分析發(fā)育時(shí)期對(duì)菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的影響。其中處理初花期的植株得到了約0.1%的種子轉(zhuǎn)化率,高于處于現(xiàn)蕾期和側(cè)薹初花期的菜心轉(zhuǎn)化率,但三者并沒有顯著差異。處于側(cè)薹發(fā)育期的菜心植株轉(zhuǎn)化率是主薹初花期和蕾期的1.8倍和3倍,表明真空滲入處理菜心的適宜時(shí)期是側(cè)薹發(fā)育期。(2)對(duì)不同濃度的菌液處理得到的轉(zhuǎn)化率分析結(jié)果表明,菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化事件有顯著影響。在0.0025～0.4000的不同OD600處理中,菌液吸光度值在0.2時(shí)獲得了高達(dá)0.12%的種子轉(zhuǎn)化率。(3)對(duì)不同壓強(qiáng)和時(shí)間處理的轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,壓強(qiáng)與時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效果有極顯著的影響。其中壓強(qiáng)為10 kPa,滲入處理時(shí)間為5 min時(shí)獲得了最高的轉(zhuǎn)化率。(4)通過對(duì)表面活性劑Silwet L-77四種不同濃度的處理,發(fā)現(xiàn)0.0025%,0.005%,0.01%和0.02%的Silwet L-77對(duì)菜心真空滲入轉(zhuǎn)化影響顯著,處理菜心最適宜的濃度為0.01%。(5)通過對(duì)不同的蔗糖濃度處理獲得轉(zhuǎn)化率的顯著性分析發(fā)現(xiàn),不同濃度的蔗糖處理得到的轉(zhuǎn)化率差異不顯著。蔗糖含量為3%時(shí)可以得到更好的轉(zhuǎn)化效果。(6)對(duì)影響菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的菌液濃度、滲入時(shí)間、轉(zhuǎn)化介質(zhì)中表面活性劑和蔗糖含量進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),得到適宜菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的體系為：菜心處于側(cè)薹初花期,處理壓強(qiáng)10 kPa,滲入時(shí)間為5.5 min,菌液吸光度值為0.2,轉(zhuǎn)化介質(zhì)中表面活性劑與蔗糖的含量分別為0.0125%和3%。(7)通過對(duì)真空滲入轉(zhuǎn)化菜心植株與野生型植株的不同雜交方式獲得轉(zhuǎn)化率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,真空滲入處理植株作為父本時(shí),母本為野生型的植株得到了0.0039%種子轉(zhuǎn)化率,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于真空滲入處理植株作為母本時(shí)獲得的轉(zhuǎn)化率,表明花粉可能通過將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至胚珠完成轉(zhuǎn)化,但轉(zhuǎn)化效率極低。通過對(duì)菜心花序上下部種子的轉(zhuǎn)化率比較得知,收獲的上部種子轉(zhuǎn)化率高達(dá)0.133%,是下部種子轉(zhuǎn)化率的1.6倍,說明農(nóng)桿菌更易轉(zhuǎn)化上部的花蕾,表明轉(zhuǎn)化發(fā)生在花蕾發(fā)育晚期之前。(8)用含有潮霉素的培養(yǎng)基和潮霉素浸種兩種方式對(duì)轉(zhuǎn)基因T1代種子進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基篩選得到的轉(zhuǎn)化率是浸種法得到轉(zhuǎn)化率的4倍,表明不同篩選方式對(duì)轉(zhuǎn)基因效率有明顯影響。
【關(guān)鍵詞】：菜心 農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化 真空滲入 影響因素
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S634.5
【目錄】：

• 致謝6-9
• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 前言13-15
• 1 文獻(xiàn)綜述：十字花科作物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展15-25
• 1.1 十字花科植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化15-19
• 1.1.1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化機(jī)制15-16
• 1.1.2 葉盤轉(zhuǎn)化法16-17
• 1.1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的原位轉(zhuǎn)化法17-19
• 1.1.3.1 種子轉(zhuǎn)化法17-18
• 1.1.3.2 分生組織轉(zhuǎn)化18
• 1.1.3.3 花器官轉(zhuǎn)化18-19
• 1.2 原位轉(zhuǎn)化機(jī)理與影響真空滲入轉(zhuǎn)化的因素19-25
• 1.2.1 原位轉(zhuǎn)化機(jī)理19-20
• 1.2.1.1 轉(zhuǎn)化目標(biāo)19-20
• 1.2.1.2 轉(zhuǎn)化時(shí)間20
• 1.2.2 影響原位轉(zhuǎn)化的因素20-25
• 1.2.2.1 溫度20-21
• 1.2.2.2 農(nóng)桿菌菌株和植物基因型21
• 1.2.2.3 農(nóng)桿菌OD_(600)和轉(zhuǎn)化介質(zhì)21-22
• 1.2.2.4 植株發(fā)育時(shí)期22
• 1.2.2.5 滲入處理22-25
• 2 材料與方法25-31
• 2.1 植物材料25
• 2.2 供試菌株及質(zhì)粒25
• 2.3 培養(yǎng)基與溶液配制25-26
• 2.4 藥品與試劑26
• 2.5 儀器與設(shè)備26
• 2.6 菜心不同發(fā)育時(shí)期的處理26
• 2.7 不同壓強(qiáng)與滲入時(shí)間的處理26-27
• 2.8 農(nóng)桿菌不同菌液濃度的真空滲入處理27
• 2.9 不同濃度表面活性劑Silwet L-77的處理27
• 2.10 不同蔗糖濃度的處理27
• 2.11 不同因素的正交設(shè)計(jì)27
• 2.12 菌液準(zhǔn)備與真空滲入轉(zhuǎn)化處理27-28
• 2.13 后期管理與種子收獲28
• 2.14 潮霉素(Hyg)最佳致死濃度的確定與轉(zhuǎn)基因菜心T_1代種子的抗性篩選28-29
• 2.15 轉(zhuǎn)化株鑒定29
• 2.16 數(shù)據(jù)處理與分析29-31
• 3 結(jié)果31-47
• 3.1 載體的構(gòu)建與真空滲入處理轉(zhuǎn)基因苗的PCR檢測(cè)31-32
• 3.1.1 載體的構(gòu)建31
• 3.1.2 真空滲入處理轉(zhuǎn)基因苗的PCR檢測(cè)31-32
• 3.2 菜心不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)化效果的比較32-34
• 3.3 農(nóng)桿菌OD_(600)對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響34-36
• 3.4 壓強(qiáng)與時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響36-38
• 3.4.1 壓強(qiáng)與時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響36-38
• 3.4.2 花序浸蘸法處理菜心38
• 3.5 不同濃度表面活性劑Silwet L-77對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響38-39
• 3.6 蔗糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響39-41
• 3.7 最佳轉(zhuǎn)化體系的確定41-43
• 3.8 潮霉素致死濃度的確定和對(duì)轉(zhuǎn)基因菜心T_1代種子的篩選43
• 3.9 花序中不同部位的花蕾的轉(zhuǎn)化效果比較43
• 3.10 種子轉(zhuǎn)化率與植株轉(zhuǎn)化率的關(guān)系43-45
• 3.11 不同雜交方式的轉(zhuǎn)化率比較45-47
• 4 討論47-53
• 4.1 菜心發(fā)育時(shí)期對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響47
• 4.2 菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響47-48
• 4.3 壓強(qiáng)與時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化事件的影響48
• 4.4 表面活性劑Silwet L-77對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響48
• 4.5 蔗糖在真空滲入菜心中的作用48-49
• 4.6 轉(zhuǎn)化部位與轉(zhuǎn)化時(shí)間49
• 4.7 花序浸蘸法轉(zhuǎn)化菜心的可行性49
• 4.8 轉(zhuǎn)基因后代的篩選49-50
• 4.9 提高農(nóng)桿菌真空滲入轉(zhuǎn)化率的措施50-51
• 4.10 結(jié)論51-53
• 參考文獻(xiàn)53-57

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 金萬梅,鞏振輝;芥菜真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化體系適宜苗態(tài)的建成[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2000年04期

2 宋正旭,鞏振輝,金萬梅,顧麗紅;小白菜植株原位真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化適宜苗態(tài)建成方法的研究[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2002年03期

3 劉巧真;王永亮;劉衛(wèi)群;李浩;王小彥;;真空滲入浸染轉(zhuǎn)化煙草的初步研究[J];河南農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年03期

4 金萬梅,鞏振輝,呂元紅;芥菜植株原位真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2004年03期

5 曹傳增,劉凡,趙泓,蔡民華,徐恒戩;影響不結(jié)球白菜真空滲入轉(zhuǎn)基因頻率的幾個(gè)因素[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2003年04期

6 金萬梅,鞏振輝,呂元紅;芥菜植株原位真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2004年03期

7 金萬梅,鞏振輝,宋正旭,宋獻(xiàn)軍,嚴(yán)慧玲;通過植株原位真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因芥菜[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2003年05期

8 張廣輝,鞏振輝,薛萬新,陳啟林;大白菜和油菜真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化法初報(bào)[J];西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1998年04期

9 張軍杰;劉凡;趙泓;羅晨;;蛋白酶抑制劑基因真空滲入法轉(zhuǎn)化不結(jié)球白菜獲得抗蟲性材料[J];植物保護(hù)學(xué)報(bào);2006年01期

10 夏雙梅,張進(jìn),汪新娥,高振峰,張廣輝;真空滲入對(duì)菜薹葉表面掃描結(jié)構(gòu)的影響[J];信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2001年02期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉凡;徐恒戩;;白菜中農(nóng)桿菌介導(dǎo)真空滲入轉(zhuǎn)基因機(jī)理研究[A];全國植物分子育種研討會(huì)摘要集[C];2009年

2 金萬梅;鞏振輝;呂元紅;;芥菜植株原位真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究[A];中國園藝學(xué)會(huì)第六屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2004年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 徐恒戩;利用真空滲入法獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲白菜及其轉(zhuǎn)化機(jī)理的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 宋麗敏;提高菜心真空滲入轉(zhuǎn)基因效率的研究[D];浙江大學(xué);2016年

2 宋正旭;小白菜植株原位真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2002年

3 金萬梅;芥菜（Brassica juncea Coss）植株原位真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2001年

4 嚴(yán)慧玲;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2003年

5 曹傳增;抗蟲基因載體的構(gòu)建及白菜轉(zhuǎn)基因研究[D];首都師范大學(xué);2003年

  本文關(guān)鍵詞：提高菜心真空滲入轉(zhuǎn)基因效率的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：287056