蜜蜂是一種真社會(huì)性昆蟲,擁有一套完善、精細(xì)的語(yǔ)言通訊系統(tǒng),是群體與個(gè)體能夠正常生長(zhǎng)、發(fā)育與繁衍的重要保證。蜂王上顎腺信息素是蜂群中一種重要信息素,具有重要生物學(xué)功能,比如具有調(diào)控工蜂行為、促進(jìn)群內(nèi)工蜂參加采集活動(dòng)、在蜂王婚飛過程中吸引雄蜂等。本文在對(duì)中華蜜蜂蜂王上顎腺信息素受體基因AcOr170、AcOr10的克隆與表達(dá)基礎(chǔ)上,研究了雄蜂對(duì)蜂王上顎腺信息素的選擇效果。以中華蜜蜂(Apis cerana cerana)為研究對(duì)象,采用自行設(shè)計(jì)的引物對(duì)雄蜂觸角中氣味受體基因(Odorant receptors 170)AcOr170的cDNA序列進(jìn)行了克隆和序列分析。以探尋中華蜜蜂雄蜂氣味受體AcOr170基因在近緣種昆蟲間的進(jìn)化差異。結(jié)果表明:中華蜜蜂雄蜂氣味受體基因AcOr170的cDNA序列總長(zhǎng)度為1556 bp,編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1188 bp,共編碼396個(gè)氨基酸,其分子量為46.272 kDa,等電點(diǎn)8.96,Genbank登錄號(hào):KX264359。結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果顯示,該蛋白具有7tm-6一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。經(jīng)序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn),Or170的序列在中華蜜蜂、西方蜜蜂和大蜜蜂間的親緣性很近。以中華蜜蜂為研究對(duì)象,采集中華蜜蜂雄蜂觸角,提取其總RNA,采用RT-PCR技術(shù)克隆中華蜜蜂Or10基因的序列。利用生物信息學(xué)軟件分析該基因的氨基酸序列。通過熒光定量PCR技術(shù)(quantitative real-time PCR)分析其在巢門口未性成熟、巢門口性成熟、巢脾上未性成熟、巢脾上性成熟雄蜂(分別記作:Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組)觸角和大腦中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明:克隆到中華蜜蜂Or10基因(命名為AcOr10)(GenBank登錄號(hào):MF693365)cDNA序列,長(zhǎng)度為914 bp,編碼區(qū)長(zhǎng)738bp,編碼246個(gè)氨基酸,其蛋白質(zhì)分子量為28.163 kD,理論等電點(diǎn)為5.50。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,中華蜜蜂AcOr10與西方蜜蜂(Apis mellifera)AmOr10、小蜜蜂(Apis florea)AfOr4-like基因聚成一支;雄蜂觸角中AcOr10表達(dá)量的熒光定量PCR結(jié)果表明:Ⅱ組和Ⅳ組顯著高于Ⅰ組和Ⅲ組(P0.05),Ⅰ組與Ⅲ組、Ⅱ組與Ⅳ組觸角中AcOr10表達(dá)量差異不顯著(P0.05);雄蜂大腦中AcOr10表達(dá)量的熒光定量PCR結(jié)果表明:Ⅱ組顯著高于Ⅰ組、Ⅲ組和Ⅳ組(P0.05),但后三者的差異不顯著(P0.05);Ⅰ組、Ⅲ組和Ⅳ組觸角中AcOr10的表達(dá)量都顯著高于相同生理狀態(tài)下大腦中AcOr10的表達(dá)量(P0.05),但Ⅱ組觸角和大腦中AcOr10的表達(dá)量差異不顯著(P0.05)。以中華蜜蜂為研究對(duì)象。分別在巢門口和巢脾上抓取雄蜂,利用行為學(xué)觀察方法檢測(cè)三種信息素對(duì)雄蜂的吸引效果。結(jié)果表明:10μg/μL反式-9-氧代-2-癸烯酸(9-ODA)組對(duì)巢門口雄蜂的吸引力顯著高于1μg/μL組和100μg/μL組(P0.05),表明過高或過低的濃度均不能有效吸引雄蜂;1μg/μL對(duì)羥基苯甲酸甲酯(HOB)組對(duì)巢門口雄蜂吸引力顯著高于10μg/μL組和100μg/μL組(P0.05),表明低濃度的HOB對(duì)于巢門口雄蜂的吸引力更強(qiáng);10μg/μL組和100μg/μL組的4-羥基-3-甲氧苯基乙醇(HVA)對(duì)巢門口雄蜂的吸引力均顯著高于1μg/μL組(P0.05)。另外,不同濃度的蜂王上顎腺信息素對(duì)巢脾上雄蜂的吸引力差異不顯著(P0.05)。
【學(xué)位單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S891
【部分圖文】：

圖 1 AcOr170 基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequence of AcOr170：橫線標(biāo)注部分為 7tm-6 一個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域。Note: the part marked in lines means a highonserved structure of 7tm-6..3.2 核苷酸序列分析所得測(cè)序結(jié)果通過 BLAST 比對(duì)，找到了 2 條與 AcOr170 同源的序列，通過 Clustal 的多重序列比對(duì)，分析 AcOr170 與其它物種的同源性（圖 2）。從圖 2 中能發(fā)現(xiàn)，氣味受體的 DNA 序列長(zhǎng)度在中華蜜蜂 Or170（AcOr170）、大蜜蜂 Or22c-likeAdOr22c-like）、西方蜜蜂 Or170（AmOr170）中有一定差異，但外顯子區(qū)長(zhǎng)度是較保守的。通過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)：AcOr170 與 AdOr22c-like、AmOr170 一致性分別 90.57%，87.47%。

8圖 2 AcOr170 核苷酸序列與其它昆蟲相應(yīng)序列的比對(duì)Fig.2 Nucleotide sequences alignment of AcOr170 with that of other insects：-----代表缺少的堿基。Note: -----represent the missing base.AcOr170: Apis cerana ceranaOr170JN544932）; AmOr170: Apis mellifera Or170（NM_001242993.1）; AdOr22c-like: Apis dorsatar22c-like（XM_006619001.1）..3.3 編碼區(qū)氨基酸序列分析將 AcOr170 核苷酸序列通過 Bioedit 軟件按照六讀框翻譯得出，AcOr170 外顯子編碼 396 個(gè)氨基酸。經(jīng) BLAST 比對(duì)，在結(jié)果中找出 4 條與其同源的膜翅目昆蟲氨酸序列（圖 3）。序列比對(duì)結(jié)果表明，AcOr170 與大蜜蜂 Or22c-like（AdOr22c-like）

9圖 3 AcOr170 氨基酸序列與其它膜翅目昆蟲相應(yīng)序列比對(duì)圖Fig.3 Amino acid sequences alignment of AcOr170 with that of other insects in Hymenoptera注：-----代表缺少的氨基酸。Note: -----resperant the missing amino acid. AcOr170: Apis cerana ceranaOr170（JN544932）; AdOr22c-like: Apis dorsata Or22c-like（XM_006619001.1）; AmOr170: Apismellifera Or170（NM_001242993.1）; AfOr67a-like: Apis florea Or67a-like（XP_003692912.1）;AmOr22c-like: Apis mellifera Or22c-like（XP_006564342.1）.2.3.4 聚類分析根據(jù) AcOr170 氨基酸同源性的比對(duì)結(jié)果，采用 Mega6.0 軟件中的 NJ 法構(gòu)建中華蜜蜂 Or170 與其它四種蜜蜂氣味受體系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖 4）。從圖 4 可以看出，中華蜜蜂 Or170 與西方蜜蜂 Or170 及大蜜蜂 Or22c-like 可以聚成一支，他們的親緣性較近；小蜜蜂 Or67a-like 與西方蜜蜂 Or22c-like 聚成一支，他們兩個(gè)親緣關(guān)系較近，而與中華蜜蜂 Or170 親緣性較遠(yuǎn)。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2849759