甜瓜(Cucumis melo L.)為葫蘆科一年生蔓生草本植物,是一種營養(yǎng)豐富的水果和重要的園藝作物,也是研究果實成熟的理想材料。在植物細胞壁中,擴展蛋白(Expansins)是其重要組成部分之一,通過催化初生壁纖維素與半纖維素之間的非共價鍵斷裂,促使細胞壁組分位移和細胞壁伸展,導(dǎo)致細胞吸水膨大,并且參與pH梯度依賴的細胞壁軟化。本研究對擴展蛋白基因在甜瓜果實發(fā)育過程中的生物學(xué)功能進行初步分析,為甜瓜品質(zhì)改良提供理論基礎(chǔ),具有重要的科學(xué)意義。本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定甜瓜基因組中35個擴展蛋白基因家族成員。根據(jù)MELONMICS數(shù)據(jù)庫中的物理位置信息對擴展蛋白基因家族染色體位置進行分析,結(jié)果顯示,除了5號染色體上沒有該家族基因分布外,該家族基因在各染色體上的分布不均。繪制了甜瓜擴展蛋白基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖,分析結(jié)果表明,除登錄號為MELO3C015695T2的基因外,其它家族成員均含有1~4個內(nèi)含子;對甜瓜、黃瓜和擬南芥的擴展蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,可將35個甜瓜擴展蛋白分為四個進化分支:EXPA,EXPB,EXLA,EXLB。通過RT-PCR克隆得到CmEXPA8、CmEXPA12基因的cDNA序列,表達分析表明,CmEXPA8基因在果實發(fā)育過程中表達量上調(diào),而CmEXPA12基因隨果實成熟度增加表達量降低。構(gòu)建了這兩個基因的超表達載體p PZP-EA8和pPZP-EA12及CRISPR/Cas9基因組編輯載體pCRI-EA8和p CRI-EA12,利用瞬時表達技術(shù)侵染甜瓜果實,觀察發(fā)現(xiàn)注射攜帶CmEXPA8基因CRISPER/Cas9載體的農(nóng)桿菌菌液的部位呈現(xiàn)保持綠色的表型;而注射攜帶CmEXPA12基因超表達載體與CRISPR/Cas9基因組編輯載體的農(nóng)桿菌菌液的部位均未出現(xiàn)明顯表型變化。采用子房注射法,將上述載體分別導(dǎo)入甜瓜獲得T_1代轉(zhuǎn)化種子,PCR檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)pPZP-EA8、pCRI-EA8、pPZP-EA12和pCRI-EA12載體的陽性率分別為13.3%,16.7%,15%和23.3%。pPZP-EA8與pCRI-EA8轉(zhuǎn)化得到的T_1代甜瓜果實分別呈現(xiàn)提前成熟和推遲成熟的表型,表明CmEXPA8基因在果實成熟過程中具有促進作用,而pCRI-EA12轉(zhuǎn)化得到的T_1代甜瓜果實與同時期授粉的野生型果實相比出現(xiàn)果體變小的表型,表明CmEXPA12基因促進甜瓜果實生長期的膨大生長。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S652
【部分圖文】：

蛋白基因家族成員的鑒定及 CmEXPA8 和 CmEXPA12 基因在果實發(fā)育中功能的。反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性 5 min；98℃ 變性 10 s，5 個循環(huán)；68℃延伸補平 7 min。產(chǎn)物用 1.0%瓊脂糖凝膠電物產(chǎn)物各取 1 μL 作為第二輪 PCR 反應(yīng)模板，反應(yīng)體系如下5 μmol/L），4 μL 下游引物（5 μmol/L），10 μL 5×PP （ 2.5 mM each ） ， 2 μL Prime STAR GXL DNA Pl 補足 50 μL。反應(yīng)條件為: 95℃ 預(yù)變性 5 min;；98℃ 變 30 s，30 個循環(huán)；68℃延伸補平 7 min。擴增產(chǎn)物用瓊脂

甜瓜擴展蛋白基因家族成員的鑒定及 CmEXPA8 和 CmEXPA12 基因在果實發(fā)育中功能的初步分析3.2 甜瓜擴展蛋白家族基因結(jié)構(gòu)分析為明確甜瓜擴展蛋白基因家族各基因的外顯子與內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)，利用在線 GSDS 軟件，根據(jù)甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫中各基因的 CDS 和 DNA 序列，繪制甜瓜擴展蛋白基因的外顯子－內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖（圖 3.1）。分析結(jié)果表明，除登錄號 MELO3C015695T2 的基因外，其他家族成員均含有 1~4 個內(nèi)含子。

內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文3.3 甜瓜擴展蛋白家族的進化分析研究甜瓜擴展蛋白家族成員間的進化關(guān)系，利用 MEGA 5.1 軟件對甜瓜、擬擴展蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，35 個甜瓜擴展蛋白可被分為四個XPA，EXPB，EXLA，EXLB，這四個亞家族分別含有 21、3、8 和 3 個擴展蛋被認為是在酸性條件下誘導(dǎo)細胞壁松弛的調(diào)節(jié)介質(zhì) EXPA 亞家族包含基因數(shù)目。并根據(jù)亞家族分布情況分別命名各亞家族成員（附表）。通過分析 3 個物因家族的進化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)每一個亞家族分支均包含來自三個物種的成員，同時家族基本特征的形成早于這三個物種的分化。
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本文編號：2848580