對蝦是變溫動物,不能通過自身來調(diào)節(jié)溫度變化,而溫度作為一個重要的環(huán)境因子,可直接影響對蝦的生長、繁殖、代謝和存活等。中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)是冷水性蝦類,對低溫的耐受性較強,但放苗溫度要求不低于14℃,且水溫低于4℃時會大量死亡。凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)對低溫的耐受性較差,適宜生長的溫度為25~35℃,水溫低于18℃時則停止攝食。低溫限制了對蝦的養(yǎng)殖季節(jié)和地域,影響?zhàn)B殖業(yè)的生產(chǎn)安全,而且采用鍋爐升溫等方法維持水溫,不僅增加了成本、還污染環(huán)境。為解決由低溫引發(fā)的諸多問題,加速培育出耐低溫對蝦新品種,本研究以中國對蝦和凡納濱對蝦為實驗材料,進行低溫脅迫實驗,并利用ASReml-R評估其耐低溫和生長性狀的遺傳參數(shù),再利用Illumina HiSeq 2500高通量測序技術(shù)篩選低溫脅迫下的差異表達基因和與低溫相關(guān)的代謝途徑。主要結(jié)果如下:1.40日齡中國對蝦生長和耐低溫性狀的遺傳力評估G_(10)、G_(11)、G_(12)世代內(nèi)40日齡中國對蝦幼蝦的體重(body weight,BW)的遺傳力范圍在(0.078±0.124)~(0.680±0.233)間,體長(body length,BL)的遺傳力范圍為(0.131±0.133)~(0.825±0.246),3個世代間BW、BL的遺傳力分別為0.253±0.0888、0.206±0.0844,均為中等遺傳力,且與0差異極顯著(P0.01)。G_(10)、G_(11)、G_(12)代耐低溫性狀(CDH、TAD)的遺傳力在(0.054±0.074)~(0.265±0.091)間,均為中低等遺傳力。世代間的低溫累積存活時間(cooling degree hours,CDH)和死亡時溫度(temperature at death,TAD)的遺傳力值分別為0.077±0.038、0.076±0.029,均為低等遺傳力,且均與0有極顯著性差異(P0.01)。2.40日齡中國對蝦生長和耐低溫兩性狀間相關(guān)性BW/BL的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)均為高度正相關(guān)。G_(10)、G_(11)、G_(12)世代內(nèi)的BW/BL的遺傳相關(guān)為(0.956±0.055)~(0.987±0.003),表型相關(guān)為(0.867±0.009)~(0.941±0.004),均為高度正相關(guān),且與0存在極顯著性差異(P0.01)。世代間的BW/BL的遺傳相關(guān)為0.910±0.008,表型相關(guān)為0.902±0.004,同樣均為高度正相關(guān)且與0差異極顯著(P0.01)。CDH/TAD的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)均為高度負相關(guān)。世代內(nèi)CDH/TAD的遺傳相關(guān)在(-0.912±0.216)~(-0.671±0.364)間,表型相關(guān)在(-0.874±0.005)~(-0.547±0.017)之間,均為負相關(guān)且與0有顯著性差異(P0.05)。世代間的CDH/TAD的遺傳相關(guān)系數(shù)為-0.874±0.100,表型相關(guān)系數(shù)為-0.864±0.003,同樣均為負相關(guān),且相關(guān)系數(shù)與0有顯著性差異(P0.05)。G_(10)、G_(11)、G_(12)世代內(nèi),生長性狀(BW、BL)與CDH的遺傳相關(guān)系數(shù)在(-0.986±0.477)~(0.9914±0.7010)之間,表型相關(guān)系數(shù)在(0.0381±0.0299)~(0.1098±0.0291)之間,均為正表型相關(guān);生長性狀(BW、BL)與TAD的遺傳相關(guān)系數(shù)在(-0.374±0.310)~(0.576±0.422)間,表型相關(guān)系數(shù)在(-0.366±0.324)~(-0.0760±0.0317)間,表現(xiàn)為負表型相關(guān)。3個世代間,生長性狀(BW、BL)與CDH間的遺傳相關(guān)系數(shù)分別為-0.0945±0.371、-0.123±0.411,均為負遺傳相關(guān),表型相關(guān)系數(shù)分別為0.113±0.0172、0.125±0.0169,均為顯著正表型相關(guān)(P0.01);生長性狀與TAD的遺傳相關(guān)系數(shù)分別為-0.241±0.283、0.703±0.604,表型相關(guān)系數(shù)分別為-0.118±0.0148、-0.136±0.0146,表現(xiàn)為顯著負表型相關(guān)(P0.01)。3.基于轉(zhuǎn)錄組篩選40日齡中國對蝦低溫脅迫下的差異表達基因分析低溫脅迫組(4℃)和常溫組(18℃)中國對蝦40日齡幼蝦的轉(zhuǎn)錄組信息,結(jié)果顯示:拼接共得到127,939條Unigene,平均長度為1,190 bp。其中35%的Unigene在Nr、Swiss-prot等七大數(shù)據(jù)庫中沒有注釋�；虿町惐磉_分析共篩選到1,698個差異基因(DEGs),其中920個上調(diào)表達,778個下調(diào)表達。GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs多富集在剪接體、核糖體、膽汁分泌、ABC轉(zhuǎn)運途徑以及細胞氮化合物合成過程中。進一步分析共得到8個可能與耐低溫性狀相關(guān)的基因,其中5個上調(diào)表達,分別為ATP結(jié)合盒蛋白C類(ATP binding cassette protein C3,ABCC3)、酸性神經(jīng)酰胺酶(Acid ceramidase,ASAH)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione Stransferase,GST)、C-型凝集素(C-type lectin)、熱休克蛋白HSP70(Heat shock protein HSP70),3個下調(diào)表達,分別為假定蛋白:γ-丁基甜菜堿羥化酶(γ-Butyl Betaine Dioxygenase,γ-BBH)、β-氨基己糖苷酶A(β-Hexosaminidase A,β-HEXA)、長鏈脂肪酸-CoA連接酶(Long chain fatty acid-CoA ligase,ACSBG2)。隨機取8個差異基因,通過real time RT-PCR驗證表明它們的表達趨勢與測序結(jié)果一致,證明了RNA-Seq結(jié)果的準確性。4.基于轉(zhuǎn)錄組篩選凡納濱對蝦低溫脅迫下的差異表達基因分析凡納濱對蝦低溫脅迫組(18℃)和常溫組(24℃)肝胰腺組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)錄組測序共獲得50,921條Unigene,平均長度為828 bp,N50為1,589 bp,其中28.13%的Unigene為已知基因�；虿町惐磉_分析共篩選得到243個低溫脅迫相關(guān)基因,其中89個上調(diào)表達,154個下調(diào)表達。功能富集分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因多富集在生物結(jié)合和催化過程、過氧化物酶、溶酶體、精氨酸和脯氨酸的代謝以及氨基酸的生物合成途徑中。進一步根據(jù)Q-value共篩選出10個差異表達最顯著的基因,其中ATP結(jié)合盒蛋白B類(ATP-binding cassette protein B6,ABCB6)、C型凝集素基因、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase,GS)可能參與了凡納濱對蝦低溫應(yīng)答反應(yīng)。利用real time RT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),結(jié)果證明基于轉(zhuǎn)錄組測序篩選低溫脅迫下的差異表達基因是可行的。5.本研究發(fā)現(xiàn)ATP結(jié)合盒蛋白基因和C型凝集素基因為篩選到的中國對蝦和凡納濱對蝦共有的低溫候選基因。故推測ATP結(jié)合盒蛋白基因和C型凝集素基因可能參與調(diào)控對蝦響應(yīng)低溫脅迫的分子機制。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文凡納濱對蝦的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)資源庫。楊銘等[57]通過分析凡納濱對蝦的轉(zhuǎn)錄組序共挖掘到 14,767 條微衛(wèi)星序列(Simple sequence repeats, SSR)，且 SSR 在轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)的頻率為 16.76%。Li 等[58]對凡納濱對蝦幼蝦進行高通量測序分析，共獲109,169 個 Unigenes，其中 37.8%的 Unigenes 在 Nr 數(shù)據(jù)庫中有注釋，并經(jīng) GOKEGG 等功能注釋發(fā)現(xiàn)了一些與胚胎發(fā)育有關(guān)的基因。RNA-seq 較基因芯片(Genechip)等研究轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)，靈敏度更高、數(shù)據(jù)更準應(yīng)用更廣泛，其測序流程和原理如圖 1-1 所示[60]。) ( b )

圖 3-1 差異表達基因火山圖Fig.3-1 The ‘volcano plot’picture of differential expression genes點表示上調(diào)表達基因，綠色圓點表示下調(diào)表達基因，藍色圓點表因dots represent up-regulated genes, green dots represent down regulatedts represent non differentially expressed genes.基因 GO 富集分析運用 GOseq 方法將篩選到的 1,698 個差異基因富集到 30 個 GO-2 所示。差異基因中在生物過程類、細胞成分類和分子功能類中均過程類居多，而生物途徑類中，富集差異表達基因最多的三類是成(Cellular nitrogen compound biosynthetic process)、調(diào)控氮化合物lation of nitrogen compound metabolic process)、調(diào)節(jié)含核堿基的化合gulation of nucleobase-containing compound metabolic process)是包含三類；在細胞成分類中，最多的則是核糖體類(Ribosome)；而在分

圖 3-2 低溫下差異表達基因 GO 富集分析柱狀圖Fig.3-2 GO enrichment results of different expressed genes under cold challenge3.2.5 差異基因 KEGG 富集分析將差異基因與 KEGG 數(shù)據(jù)庫中的各代謝途徑(pathway)作比對，并從中集最顯著的前 20 個 pathway 做散點圖(圖 3-3)。差異表達基因多富集在(Spliceosome)、核糖體(Ribosome)、膽汁分泌(Bile secretion)和 ABC 轉(zhuǎn)運transporters)等途徑中。
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本文編號：2840448