鞭毛是細(xì)菌膜外的主要運(yùn)動(dòng)器官,其生物合成需要多種蛋白的參與。鞭毛的缺陷可能影響菌膜形成和分泌蛋白分泌等生物過程。因此,對鞭毛合成關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除,研究鞭毛的缺失對菌株生物學(xué)特性的影響及相關(guān)生物過程的調(diào)控機(jī)制,對工業(yè)菌株的有目的性改造具有理論指導(dǎo)意義。本論文通過敲除惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)染色體上與鞭毛合成相關(guān)的基因,構(gòu)建了鞭毛缺失的突變菌株,并通過表型分析和轉(zhuǎn)錄水平的分析探究各菌株鞭毛合成、六型分泌系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制。具體研究成果如下:(1)通過同源重組等分子生物學(xué)原理,分別敲除了惡臭假單胞菌KT2442菌株中fleQ、fliA、rpoN、bifA和hcp1等鞭毛合成相關(guān),胞內(nèi)信使c-di-GMP降解和細(xì)菌六型分泌系統(tǒng)基因,構(gòu)建了ΔfleQ、ΔfliA、ΔrpoN、Δbif A和Δhcp1等突變株,同時(shí)構(gòu)建了相應(yīng)的回補(bǔ)菌株。(2)通過半固體平板運(yùn)動(dòng)性、分泌蛋白SDS-PAGE分析、透射電子顯微鏡和RT-qPCR實(shí)驗(yàn),分別確定了fleQ、fli A和rpo N是惡臭假單胞菌中合成鞭毛所必需的基因,而bifA和hcp1的敲除對惡臭假單胞菌的鞭毛運(yùn)動(dòng)性無顯著影響。其中rpoN基因的敲除對細(xì)菌的生長具有明顯的影響,ΔrpoN的生長速率低于野生型,且穩(wěn)定期能達(dá)到的OD也低于野生型。(3)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)對數(shù)前期ΔfleQ中,包含hcp1基因的六型分泌系統(tǒng)(T6SS)的相關(guān)基因都發(fā)生了顯著上調(diào)。在對數(shù)中后期KT2442中,大多數(shù)T6SS相關(guān)的基因也發(fā)生了上調(diào),但有個(gè)別基因在兩種情況下受到了不同的調(diào)節(jié)。結(jié)果表明FleQ可能參與調(diào)控了部分T6SS基因,而不是所有的基因。同時(shí),在ΔfleQ的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中,多個(gè)編碼c-di-GMP合成或降解相關(guān)蛋白的基因受到了顯著的調(diào)節(jié)。此外,胞外多糖中纖維素合成基因和細(xì)菌表面粘附蛋白編碼基因lapA等在fleQ缺失的條件下受到調(diào)控。FleQ對纖維素的合成具有抑制作用,而對表面粘附蛋白的表達(dá)具有激活作用。(4)通過分泌蛋白SDS-PAGE和RT-qPCR實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌KT2442在對數(shù)中后期能分泌大量的六型分泌系統(tǒng)蛋白Hcp1,而在對數(shù)前期不顯著。在ΔfleQ、ΔfliA、ΔrpoN中Hcp1的分泌在對數(shù)前期有不同程度的上調(diào),明顯高于該時(shí)期的野生型。結(jié)合RT-qPCR的分析,說明FleQ和RpoN對六型分泌系統(tǒng)的表達(dá)具有抑制作用。(5)通過T6SS活性缺失菌株Δhcp1的抗細(xì)菌實(shí)驗(yàn),研究惡臭假單胞菌六型分泌系統(tǒng)的功能。發(fā)現(xiàn)該六型分泌系統(tǒng)對環(huán)境中競爭性菌株的生長具有拮抗作用。本課題中FleQ參與調(diào)控惡臭假單胞菌鞭毛合成、六型分泌系統(tǒng)、胞外多糖合成和表面粘附蛋白表達(dá)等多個(gè)生物過程,為研究和定向改造惡臭假單胞菌中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q78
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 細(xì)菌鞭毛的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.1 細(xì)菌鞭毛的結(jié)構(gòu)
        1.1.2 鞭毛相關(guān)基因的功能
    1.2 細(xì)菌六型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.1 六型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能
        1.2.2 六型分泌系統(tǒng)的調(diào)控
    1.3 惡臭假單胞菌KT2442及其應(yīng)用
    1.4 轉(zhuǎn)錄組分析及應(yīng)用
    1.5 立題背景與意義
    1.6 課題研究方案與目標(biāo)
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 主要引物
        2.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        2.1.4 工具酶和試劑
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 分子DNA操作
        2.2.2 分泌蛋白的提取與鑒定
        2.2.3 惡臭假單胞菌及突變株的生理特性實(shí)驗(yàn)
        2.2.4 轉(zhuǎn)錄組分析
        2.2.5 fleQ突變株初步發(fā)酵生產(chǎn)PHA
第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
    3.1 惡臭假單胞菌鞭毛相關(guān)突變株的構(gòu)建和生化表型分析
        3.1.1 ΔfleQ、ΔfliA、ΔrpoN、ΔbifA和Δhcp1敲除菌株和回補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        3.1.2 fleQ突變株的透射電鏡分析
        3.1.3 生長曲線的比較
        3.1.4 鞭毛相關(guān)基因突變對運(yùn)動(dòng)性的影響
        3.1.5 鞭毛相關(guān)基因突變對外膜滲透性的影響
    3.2 轉(zhuǎn)錄組分析
        3.2.1 轉(zhuǎn)錄組分析總覽
        3.2.2 差異表達(dá)基因的富集分析
        3.2.3 六型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的差異表達(dá)分析
        3.2.4 胞內(nèi)信使相關(guān)基因的差異表達(dá)分析
        3.2.5 胞外多糖和表面粘附蛋白等基因的差異表達(dá)分析
        3.2.6 鞭毛、趨化性相關(guān)基因及其它顯著調(diào)節(jié)基因的差異表達(dá)分析
    3.3 惡臭假單胞菌分泌蛋白分析
        3.3.1 P. putida KT2442在對數(shù)中后期時(shí)會(huì)分泌大量FliC和Hcp1蛋白
        3.3.2 FleQ、FliA、RpoN和BifA對P. putida KT2442鞭毛合成和六型分泌系統(tǒng)在蛋白水平上的影響
        3.3.3 FleQ、FliA、RpoN和BifA對P. putida KT2442鞭毛合成和六型分泌系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平上的影響
        3.3.4 FleQ、FliA、RpoN和BifA對P. putida KT2442鞭毛合成和六型分泌系統(tǒng)的調(diào)控分析
    3.4 惡臭假單胞菌六型分泌系統(tǒng)的功能分析
        3.4.1 Hcp1蛋白在細(xì)胞中的定位及hcp1的表達(dá)與細(xì)菌生長的關(guān)系
        3.4.2 Hcp1在KT2442和ΔfleQ中的表達(dá)強(qiáng)度比較
        3.4.3 六型分泌系統(tǒng)的抗細(xì)菌作用
    3.5 ΔfleQ突變株初步發(fā)酵生產(chǎn)PHA
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文

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4 韓金鑫;連賓;唐源;劉世榮;龔國洪;;惡臭假單胞菌對碳酸鈣的誘導(dǎo)礦化作用[J];南京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年06期

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6 ;環(huán)境保護(hù)上的應(yīng)用[J];生物技術(shù)通報(bào);1989年08期

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本文編號：2839439