杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook)是我國(guó)南方重要的速生用材樹(shù)種之一,因其具有材質(zhì)優(yōu)良和速生豐產(chǎn)等特點(diǎn)被廣泛種植,在我國(guó)林業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。長(zhǎng)期林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐表明,鋁毒是我國(guó)南方酸性土壤中制約杉木生長(zhǎng),導(dǎo)致杉木人工林產(chǎn)量下降的主要原因之一。因此如何改善酸性土壤上杉木的生長(zhǎng),提高杉木人工林產(chǎn)量已成為當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。與其他植物一樣,杉木在酸性土壤中的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程,它通過(guò)不斷整合自身發(fā)育與環(huán)境信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)自身生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。作為調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵激素之一,生長(zhǎng)素在介導(dǎo)植物響應(yīng)環(huán)境和自身發(fā)育信號(hào)中扮演著關(guān)鍵角色。盡管生長(zhǎng)素在調(diào)控植物鋁脅迫耐性中的作用早已被證實(shí)。但是,這一過(guò)程涉及生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一系列基因和調(diào)控元件,而生長(zhǎng)素早期應(yīng)答基因SAUR作為生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游基因,在介導(dǎo)生長(zhǎng)素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫調(diào)控過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。然而,迄今為止介導(dǎo)生長(zhǎng)素調(diào)控植物鋁脅迫耐性的分子機(jī)制尚不完全清楚。因此,開(kāi)展杉木ClSAUR基因家族及啟動(dòng)子克隆、不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)模式分析和鋁脅迫下基因功能研究,對(duì)于明確ClSAUR基因在杉木生長(zhǎng)發(fā)育和鋁脅迫中的作用和地位,加深對(duì)ClSAUR基因在杉木生長(zhǎng)發(fā)育和鋁脅迫中的調(diào)控作用機(jī)制的了解,并為進(jìn)一步利用基因工程手段改良杉木抗性,從而最終提高鋁脅迫下杉木人工林的產(chǎn)量提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1、杉木ClSAUR基因家族的克隆與生物信息學(xué)分析利用RT-PCR和RACE技術(shù),從杉木組培苗中克隆得到8個(gè)ClSAUR基因家族成員的cDNA和gDNA序列。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,杉木ClS4 UR基因家族均不含內(nèi)含子,所編碼的氨基酸個(gè)數(shù)在95～196之間,且所有ClSAUR蛋白均為定位于細(xì)胞質(zhì)的不具有跨膜結(jié)構(gòu)的非分泌蛋白。同時(shí),除ClSAUR25為酸性蛋白、ClSAUR36為穩(wěn)定蛋白及ClSAUR29為疏水性蛋白外,其余杉木ClSAUR蛋白成員為堿性親水的不穩(wěn)定蛋白。功能結(jié)構(gòu)域分析顯示,ClSAUR蛋白家族均屬于生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的超家族成員,含有PLN結(jié)構(gòu)。杉木ClSAUR蛋白不同成員在磷酸化位點(diǎn)數(shù)和位置上差異較大,且大部分杉木ClSAUR蛋白成員的磷酸化修飾主要是以絲氨酸為主。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明,ClSAUR2、ClSAUR24、ClSAUR25、ClSAUR29、ClSAUR36和ClSAUR39均以無(wú)規(guī)卷曲為主,而ClSAUR50和ClSAUR91則以α螺旋為主。2、杉木ClSAUR25基因的啟動(dòng)子克隆及序列分析通過(guò)熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)從杉木基因組DNA中獲得長(zhǎng)為1471 bp的ClSAUR25基因5'調(diào)控序列,該5'調(diào)控序列具有3個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū),分別位于第226～276bp、第1034～1084bp和第1234～1284 bp上,且3個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)的可能轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)均為C。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該5'調(diào)控序列共有5個(gè)CpG島,分別位于第1148～1347 bp、1149～1348 bp、1150～1349 bp、1151～1350 bp和1152～1351 bp。順式作用元件分析表明,該5'調(diào)控序列不僅含有豐富的核心元件CAAT-box和TATA-box,還存在光響應(yīng)元件、乙烯響應(yīng)元件、金屬響應(yīng)元件、厭氧響應(yīng)元件、分生組織特異性元件、胚乳表達(dá)元件、生理周期響應(yīng)元件及大量功能未知元件。此外,ClSAUR25基因可能還受bZIP類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。3、不同生理?xiàng)l件下杉木ClSAUR基因家族的表達(dá)分析利用qPCR技術(shù)分析了杉木ClSAUR基因家族在愈傷組織不同形成時(shí)期、不同組織部位以及生長(zhǎng)素不同處理時(shí)間的表達(dá)情況。結(jié)果表明ClSAUR基因家族不同成員在愈傷組織形成的不同階段表達(dá)存在明顯差異,ClSAUR2和ClSAUR24基因表達(dá)主要在杉木愈傷組織誘導(dǎo)初期和分化期受到顯著誘導(dǎo),ClSAUR25基因表達(dá)量在杉木愈傷組織誘導(dǎo)、分裂及分化整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中均顯著上調(diào),ClSAUR50、ClSAUR91和ClSAUR39則主要在杉木愈傷組織誘導(dǎo)初期受誘導(dǎo)表達(dá),暗示ClSAUR基因家族不同成員在杉木愈傷組織發(fā)育過(guò)程的不同階段扮演著不同的角色。ClSAUR基因家族不同成員組織特異性表達(dá)結(jié)果表明,不同基因成員或同一基因在不同組織中的表達(dá)存在顯著差異,其中ClSAUR2和ClSAUR39基因在葉片的相對(duì)表達(dá)量最大,ClSAUR25、ClSAUR50和ClSAUR91基因在根中相對(duì)表達(dá)量最大,ClSAUR24基因則在莖中相對(duì)表達(dá)量最大,暗示不同家族成員在不同組織部位所起的功能有所不同。此外,不同ClSAUR成員對(duì)生長(zhǎng)素的響應(yīng)情況也存在差異,其中ClSAUR24、ClSAUR25、ClSAUR39和ClSAUR91基因?qū)ιL(zhǎng)素響應(yīng)較為迅速(0.5 h就能被顯著誘導(dǎo)表達(dá)),隨后這些基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),說(shuō)明這些基因在早期生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用。而ClSAUR2在早期(0.5 h)則被生長(zhǎng)素迅速抑制表達(dá),隨后其表達(dá)量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì),暗示其可能在生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后期發(fā)揮著特定的功能。與上述生長(zhǎng)素響應(yīng)基因表達(dá)模式不同的是,ClSAUR50基因的表達(dá)相對(duì)復(fù)雜,其相對(duì)表達(dá)量整體變化呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)。4、杉木ClSAUR25基因的功能分析將ClSAUR25基因ORF構(gòu)建到pCambia1301-1表達(dá)載體中,采用農(nóng)桿菌侵染法將p1301-ClSAUR25導(dǎo)入擬南芥和煙草中,獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因煙草組培苗。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)源激素含量分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的lAA和ABA含量均高于野生型,而GA和ZR含量均低于野生型煙草。通過(guò)外源生長(zhǎng)素對(duì)煙草進(jìn)行處理,結(jié)果表明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),野生型和轉(zhuǎn)基因煙草ClSAUR25的相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì),在1 h時(shí)兩者的相對(duì)表達(dá)量顯著提高并達(dá)到峰值。整體而言,野生型煙草的ClSAUR25相對(duì)表達(dá)量均顯著低于轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)表達(dá)量。耐鋁結(jié)果分析表明,鋁脅迫顯著增加煙草體內(nèi)過(guò)氧化氫含量,而且轉(zhuǎn)基因煙草中過(guò)氧化氫增幅小于野生型,與該結(jié)果一致的是,鋁脅迫均顯著誘導(dǎo)MDA的積累,但轉(zhuǎn)基因煙草中MDA增幅小于野生型,表明轉(zhuǎn)基因煙草受到的氧化損傷較野生型小,轉(zhuǎn)基因煙草具有較強(qiáng)的耐鋁性。鋁脅迫下煙草體內(nèi)可溶性糖和脯氨酸含量分析表明,鋁脅迫顯著增加野生型煙草中可溶性糖和脯氨酸以及轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)脯氨酸的含量,但鋁脅迫顯著降低轉(zhuǎn)基因煙草中可溶性糖含量,上述結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草植株耐鋁性的增強(qiáng)與其體內(nèi)滲透物質(zhì)含量的改變關(guān)系不大。另一方面,鋁脅迫顯著增加野生型煙草中的SOD活性,而轉(zhuǎn)基因煙草中SOD活性變化不明顯,但轉(zhuǎn)基因煙草自身具有較高的本底SOD活性。鋁脅迫顯著增加野生型和轉(zhuǎn)基因煙草中POD和CAT活性,而且鋁脅迫下野生型煙草中POD酶活性增幅顯著大于轉(zhuǎn)基因煙草,鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草中CAT活性增幅顯著高于野生型,表明轉(zhuǎn)基因煙草可能通過(guò)提高CAT活性來(lái)增強(qiáng)其活性氧清除能力,減輕鋁誘導(dǎo)的氧化損傷。此外,野生型和轉(zhuǎn)基因煙草檸檬酸分泌基因NtMATE和鋁的液泡轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtALS3定量分析結(jié)果表明,鋁脅迫能顯著增加野生型和轉(zhuǎn)基因煙草中NtMATE基因的表達(dá)量,鋁脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草中NtMATE基因的表達(dá)量分別是各自對(duì)照的2.75和2.96倍,而且在正常和鋁脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草NtMATE的表達(dá)量均顯著高于野生型。另一方面,鋁脅迫對(duì)野生型煙草NtALS3基因表達(dá)的影響并不顯著,但鋁脅迫卻顯著誘導(dǎo)該基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá),鋁脅迫下其表達(dá)量是野生型的3.21倍,暗示鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草可通過(guò)增加NtMATE和NtALS3表達(dá)量,促進(jìn)有機(jī)酸的分泌和鋁向液泡中的轉(zhuǎn)運(yùn),減少轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鋁的吸收,減輕鋁的毒害,從而最終增強(qiáng)其對(duì)鋁脅迫的耐性。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S791.27
【部分圖文】：

其調(diào)控作用是ＳＣＦＴＲ１／ＡＦＢ對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Ａｕｘ／ＩＡＡ家族的蛋白酶解。其中泛素??連接酶復(fù)合物ＳＣＦＴＤＵ是由Ｆ－ｂｏｘ蛋白與ＡＳＫ１、ＣＵＬ１和ＲＢＸ蛋白組成［２Ｗ８］。ＡＲＦ??在生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程最為關(guān)鍵，處于轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的核心下游位置。由圖１－２可認(rèn)??為，在生長(zhǎng)素濃度低的條件下，ＡＲＦ轉(zhuǎn)錄因子與Ａｕｘ／ＩＡＡ抑制子相結(jié)合，從而抑??制ＡＲＦ的活性，進(jìn)一步抑制下游生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)。相反，當(dāng)生長(zhǎng)素濃度較??高時(shí)，ＳＣＦ復(fù)合體與Ａｕｘ／ＩＡＡ抑制子結(jié)合能力過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致被泛素化，從而被２６Ｓ蛋白??酶體降解，ＡＲＦ激活子便激活生長(zhǎng)素基因［２９］，這意味著其參與了２６Ｓ蛋白亞基介??導(dǎo)的靶蛋白的降解［３ｅ］。目前，＾〇／／以基因顯示了不同的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，部分??基因在生長(zhǎng)素處理?xiàng)l件下可數(shù)分鐘后表達(dá)，而其它基因卻表達(dá)延遲。??３??

２．３．１杉木總ＲＮＡ和基因組ＤＮＡ的提取結(jié)果??以杉木組培苗０２０為試驗(yàn)材料，提取杉木總ＲＮＡ，經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳??及酶標(biāo)儀檢測(cè)，結(jié)果如圖２－１，ＲＮＡ和ＤＮＡ條帶完整，ＯＤ值均在１．８？２．０之??間，可知樣品總ＲＮＡ和ＤＮＡ完整性好，雜質(zhì)較少。質(zhì)量檢測(cè)合格的ＲＮＡ和??ＤＮＡ用于后續(xù)試驗(yàn)。??Ｍｉ?１?Ｍ２?２??２０００??７５〇ＩｍＨＩ??５〇〇?，」??２００??１００?＿＿＿＿＿??圖２－１杉木總ＲＮＡ和總ＤＮＡ電泳圖??Ｆｉｇ．２－１?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ａｎｄ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｆｒｏｍ?Ｃ．ｌａｎｃｅｏｌａｔａ??注：Ｍｉ：?ＤＬ２，０００?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?１：總ＲＮＡ；?Ｍ２：人－Ｈｉｎｄ?ＩＩＩ?ｄｉｇｅｓｔ；?２：基因組ＤＮＡ??２．３．２杉木ａｓ＾ｆ／辦基因保守片段克隆??以杉木組培苗總ＲＮＡ進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到的ｃＤＮＡ作為模板，根據(jù)所設(shè)計(jì)的??保守序列引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增（圖２－２），ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)回收、連接轉(zhuǎn)化及菌液驗(yàn)??證后，挑取陽(yáng)性克隆子送華大測(cè)序，測(cè)序結(jié)果得到３１３?ｂｐ的保守序??列和４６５?ｂｐ的刃保守序列。將上述序列在ＮＣＢＩ上進(jìn)行Ｂｌａｓｔ比對(duì)，均??與己登錄的其他物種＆基因同源性較高

Ｍｌ?２３?４?Ｍ?５?６?７?８?９?１０??＿??圖２￣４杉木Ｃ７Ｓ／４Ｗ？ｓ基因的ＯＲＦ序列電泳圖??Ｆｉｇ．２－４?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ＣＩＳＡＵＲ?ＯＲＦ?ｆｒｏｍ?Ｃ．ｌａｎｃｅｏｌａｔａ??注?２＊４：?Ｍ：?ＤＬ２，０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ：?１?和?２：?的?ＯＲＦ?產(chǎn)物（４８０ｂｐ）?；?３?和?４：?的??ＯＲＦ?產(chǎn)物（３１５ｂｐ）?；?５：?Ｃ／＆４ＷＷ＜５?的?ＯＲＦ?產(chǎn)物（５５８ｂｐ）?：?６：?的?ＯＲＦ?產(chǎn)物（５９１ｂｐ）；??７：?的?ＯＲＦ?產(chǎn)物（３４２ｂｐ）?；?８：?Ｃ／５＾Ｌ？５０?的?ＯＲＦ?產(chǎn)物（５１０ｂｐ）?：?９：?的?ＯＲＦ??產(chǎn)物（４０８ｂｐ）?；?１０：?的?ＯＲＦ?產(chǎn)物（２２８ｂｐ）．??２．３．５杉木沿基因的ｇＤＮＡ序歹｜Ｊ擴(kuò)增??以杉木ＤＮＡ為模板，利用ＯＲＦ引物進(jìn)行Ｃ／＆４Ｃ／＾基因的ｇＤＮＡ序列擴(kuò)增??（圖２－５），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ＴＡ克隆及測(cè)序后，結(jié)果得到ＯＳ＾Ｗ？２、Ｃ／＆４Ｗ？％、??Ｃ�。樱粒眨遥玻�、ａＳＡＵＲ２９、ａＳＡＵＲ３６、ａＳＡＵＲ５０、ａＳＡＵＲ３９?及?ＣＩＳＡＵＲ９Ｉ?的?ｇＴ＾Ａ??序列大小分別為?４０８?ｂｐ、５９１?ｂｐ、３１５?ｂｐ、２８８?ｂｐ、５５８?ｂｐ、５１０?ｂｐ、３４２?ｂｐ?和??４８０?ｂｐ。??Ｍ１２?３４５６７８??圖２－５杉木０＾［／沿基因的ｇＤＮＡ片段電泳圖??Ｆｉｇ．２－５?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ＣＩＳＡＵＲｓ?ｇ?ＤＮＡ?ｆｒｏｍ?Ｃｈｉｎｅｓｅ?ｆｉｒ??注?２－５：?Ｍ：?ＤＬ２
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2835339