山西省是設(shè)施蔬菜生產(chǎn)大省,溫室內(nèi)CO_2虧缺是制約溫室蔬菜提質(zhì)增效的重要因素。為研究番茄響應(yīng)低濃度CO_2基因的功能,以及探討光合碳同化相關(guān)基因共表達(dá)對番茄應(yīng)答低濃度CO_2的作用,本試驗(yàn)以番茄“合作908”為材料,克隆了番茄碳同化相關(guān)基因/cCA1、和FBA,通過構(gòu)建βCA1+SBP+FBA多基因共表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行番茄遺傳轉(zhuǎn)化,最終獲得βCA1、SBP和FBA三個(gè)基因共同表達(dá)的番茄轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果如下:(1)從番茄葉片中克隆了番茄碳同化相關(guān)的βCA1、SBP和FBA;(2)利用連接肽“2A”構(gòu)建了含βCA1、SBP和FBA的多基因共表達(dá)載體;(3)對番茄再生體系進(jìn)行了優(yōu)化,篩選出褐化程度低的番茄再生體系:誘茅培養(yǎng)基:MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+500 mg/L Cef+400 mg/mL PVP/40,生根培養(yǎng)基 MS+0.1 mg/L IAA+250 mg/L Cef;(4)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行番茄遺傳轉(zhuǎn)化,獲得了高表達(dá)βCA1、SBP和FBA的番茄T1代轉(zhuǎn)基因植株。
【學(xué)位單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S641.2
【部分圖文】：

個(gè)基因間加有連接肽“２Ａ”和引導(dǎo)肽ＳＳＵ，當(dāng)融合基因進(jìn)入真核生物體內(nèi)表達(dá)時(shí)，連逡逑接肽“２Ａ”會(huì)發(fā)生自我剪切，引導(dǎo)肽ＳＳＵ會(huì)帶有不同的目的基因進(jìn)入到生物體內(nèi)各逡逑自發(fā)生反應(yīng)的部位進(jìn)行表達(dá)。構(gòu)建策略如圖２－１。逡逑Ｎｃｏｌ邐ＢｓｔＥＩＩ逡逑Ｉ邋Ｉ逡逑ＲＢ邋ＰＣＡ１邐２ＡＳＳＵ邋ＳＢＰ邐２Ａ邋ＳＳＵ邐ＦＢＡ邐ＬＢ逡逑圖２－丨表達(dá)載體構(gòu)建策略逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｅｘｐｒｅｓｓ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ逡逑在２２０邋ｒ／ｍｉｎ，３７°Ｃ的震蕩培養(yǎng)器中，把含有ＰＣ４／＋仰Ｐ＋ＦＳ／Ｉ多基因的大腸桿菌和逡逑表達(dá)載體ＰＣＡＭＢＩＡ１３０１菌液分別放入含有Ａｍｐ和Ｋａｎａ抗生素的ＬＢ液體培養(yǎng)基中逡逑培養(yǎng)直至有明顯渾濁，利用質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒，把多基因共表達(dá)載體質(zhì)粒逡逑與ＰＣＡＭＢＩＡ１３０１表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳檢測并回收目的片段，與逡逑ＰＣＡＭＢＩＡ１３０１表達(dá)載體連接，如圖２－２。構(gòu)建好多基因共表達(dá)載體逡逑后轉(zhuǎn)化到ＤＨ５ａ感受態(tài)中，涂布在加有Ｋａｎａ抗生素的ＬＢ平板上，挑取單菌落進(jìn)行菌逡逑液ＰＣＲ驗(yàn)證和測序

個(gè)基因間加有連接肽“２Ａ”和引導(dǎo)肽ＳＳＵ，當(dāng)融合基因進(jìn)入真核生物體內(nèi)表達(dá)時(shí)，連逡逑接肽“２Ａ”會(huì)發(fā)生自我剪切，引導(dǎo)肽ＳＳＵ會(huì)帶有不同的目的基因進(jìn)入到生物體內(nèi)各逡逑自發(fā)生反應(yīng)的部位進(jìn)行表達(dá)。構(gòu)建策略如圖２－１。逡逑Ｎｃｏｌ邐ＢｓｔＥＩＩ逡逑Ｉ邋Ｉ逡逑ＲＢ邋ＰＣＡ１邐２ＡＳＳＵ邋ＳＢＰ邐２Ａ邋ＳＳＵ邐ＦＢＡ邐ＬＢ逡逑圖２－丨表達(dá)載體構(gòu)建策略逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｅｘｐｒｅｓｓ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ逡逑在２２０邋ｒ／ｍｉｎ，３７°Ｃ的震蕩培養(yǎng)器中，把含有ＰＣ４／＋仰Ｐ＋ＦＳ／Ｉ多基因的大腸桿菌和逡逑表達(dá)載體ＰＣＡＭＢＩＡ１３０１菌液分別放入含有Ａｍｐ和Ｋａｎａ抗生素的ＬＢ液體培養(yǎng)基中逡逑培養(yǎng)直至有明顯渾濁，利用質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒，把多基因共表達(dá)載體質(zhì)粒逡逑與ＰＣＡＭＢＩＡ１３０１表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳檢測并回收目的片段，與逡逑ＰＣＡＭＢＩＡ１３０１表達(dá)載體連接，如圖２－２。構(gòu)建好多基因共表達(dá)載體逡逑后轉(zhuǎn)化到ＤＨ５ａ感受態(tài)中，涂布在加有Ｋａｎａ抗生素的ＬＢ平板上，挑取單菌落進(jìn)行菌逡逑液ＰＣＲ驗(yàn)證和測序

凝膠電泳可以清楚的得出，在不同溫度下ＰＣＲ擴(kuò)增條帶清晰度不？致，盡可能選擇清逡逑晰度好、溫度高的孔樣溫度作為最適退火溫度，經(jīng)過分析，最終確定和劃／１的逡逑最適退火溫度為５８．８°Ｃ，見下圖３－２中Ａ和Ｂ，邐的最適退火溫度為５６．９°Ｃ邋，見下逡逑圖３－２中Ｃ，篩選出最適退火溫度后用于后續(xù)目的基因＾ＣＶ１７、Ｆ似全長序列進(jìn)逡逑行擴(kuò)增。逡逑－１７－逡逑

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本文編號：2834722