小干擾RNA沉默Btbd7基因?qū)θ搜浪杓?xì)胞生物學(xué)行為的影響

發(fā)布時(shí)間：2020-09-25 20:16

　　背景和目的牙髓組織位于牙齒的中心,是一種疏松的結(jié)締組織,其血液供應(yīng)主要來源于根尖孔細(xì)小的血管,沒有有效的側(cè)枝循環(huán),在外界炎癥等刺激作用下,牙髓組織的局部損傷通常都是不可逆的,可以導(dǎo)致牙髓組織的壞死并向根尖周組織進(jìn)一步發(fā)展。牙髓組織具有形成牙本質(zhì)的能力,在外界因素的影響下,也可以形成一種反應(yīng)性/修復(fù)性牙本質(zhì)。牙髓組織的這種功能,在牙齒的發(fā)育形成和修復(fù)再生當(dāng)中起著非常重要的作用。人牙髓細(xì)胞(human dental pulp cells,hDPCs)是人牙髓組織的主要細(xì)胞,也是牙本質(zhì)的形成和再生過程中發(fā)揮重要作用的主要細(xì)胞。牙髓細(xì)胞在不同因子的影響下,具有分化成為各種類型細(xì)胞的潛力,如成骨細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞等等。在牙髓組織的局部損傷修復(fù)過程中,主要依靠的是成牙本質(zhì)細(xì)胞形成修復(fù)性牙本質(zhì)從而發(fā)揮保護(hù)作用。根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道,許多基因在這個(gè)過程中發(fā)揮一定的作用。牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,Dspp)就是牙本質(zhì)當(dāng)中的一種非膠原蛋白,能夠調(diào)控牙齒的生長發(fā)育,在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)礦化過程中發(fā)揮著重要的作用。Btbd7基因定位于人類染色體14q32.12區(qū)域,其編碼的蛋白質(zhì)由1132個(gè)氨基酸組成,相對分子質(zhì)量為126368。Btbd7在各種癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著非常重要的作用,包括肺癌、肝癌和唾液腺樣囊性癌等。Btbd7作為一種調(diào)節(jié)基因,能夠促進(jìn)上皮組織的改建和支器官的形成。有研究表明,Btbd7是上皮組織重塑和分支器官形成的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)因子。在胚胎時(shí)期,肺、唾液腺和牙根的形成過程中發(fā)揮重要作用。課題組發(fā)現(xiàn),Btbd7在大鼠牙髓中也有表達(dá),然而,Btbd7在人牙髓細(xì)胞中的表達(dá)尚未被證實(shí)。課題組以往研究發(fā)現(xiàn)Btbd7基因存在于大鼠牙髓中,本課題同樣檢測出Btbd7存在于人牙髓細(xì)胞當(dāng)中,我們利用小干擾RNA沉默人牙髓細(xì)胞中的Btbd7基因,從檢測其對牙髓細(xì)胞增殖的影響和對Dspp基因影響的角度出發(fā),進(jìn)一步研究Btbd7對人牙髓細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,從而推斷Btbd7缺失是否會(huì)導(dǎo)致牙齒發(fā)育異常和鈣化異常,在牙本質(zhì)的形成和修復(fù)性牙本質(zhì)的再生過程中發(fā)揮一定的作用。材料與方法1.選取出生后第5、8、11、15、19天的Wistar大鼠幼鼠,脫頸處死后解剖出上下頜骨,取其第一磨牙,脫礦后制作石蠟切片。進(jìn)行HE染色、Btbd7免疫組化染色。觀察不同時(shí)期大鼠牙胚組織的發(fā)育情況,根據(jù)免疫組化結(jié)果檢測大鼠磨牙牙髓中Btbd7的表達(dá)。2.原代hDPCs的獲取和細(xì)胞傳代培養(yǎng)應(yīng)用酶解組織塊法從18-25歲的健康人第三磨牙中分離獲得原代hDPCs。進(jìn)一步傳代培養(yǎng),獲取得生長狀態(tài)良好的第3-5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。3.細(xì)胞免疫組化對牙髓細(xì)胞進(jìn)行Btbd7的免疫組織化學(xué)染色,對照組用PBS代替一抗。4.siRNA 轉(zhuǎn)染應(yīng)用 siRNA-Btbd7 或 siRNA-Ncontrol,以脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000為介導(dǎo)對hDPCs進(jìn)行瞬時(shí)基因敲除。轉(zhuǎn)染前,HDPCs在無雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)48小時(shí),采用熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)檢測基因敲除后Btbd7的表達(dá)水平。5.采用RT-PCR技術(shù)檢測siRNA-Btbd7干擾48小時(shí)后hDPCs中Dspp基因的表達(dá)水平。6.采用Western blot技術(shù)檢測siRNA-Btbd7干擾48小時(shí)后hDPCs中Dspp蛋白的表達(dá)水平。7.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)應(yīng)用細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒(CCK-8)檢測Btbd7對hDPCs增殖活性的影響。8.統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行處理,設(shè)P0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.HE染色結(jié)果:幼鼠出生后5天,牙胚處于鐘狀期晚期,磨牙冠部牙本質(zhì)部分形成,牙頸部形成頸環(huán)結(jié)構(gòu),但上皮根鞘結(jié)構(gòu)不明顯,牙根尚未開始發(fā)育;第8天,磨牙冠部基本發(fā)育完成,根部開始發(fā)育,內(nèi)、外釉上皮在頸環(huán)處增生,可以見到上皮根鞘結(jié)構(gòu);第11天,磨牙冠部發(fā)育進(jìn)一步完善,根部上皮根鞘繼續(xù)生長,牙本質(zhì)繼續(xù)發(fā)育,開始形成上皮隔;第15天,磨牙冠部發(fā)育完成,根部發(fā)育完成一半,可以見到根分叉結(jié)構(gòu);第19天,磨牙牙根基本形成,并繼續(xù)生長。免疫組化染色:在Wistar大鼠的牙髓組織和體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞當(dāng)中,可以觀察到Btbd7陽性表達(dá),染色主要位于成牙本質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上。2.轉(zhuǎn)染結(jié)果:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,在hDPCs中siRNA-Btbd7組與siRNA-Ncontrol組相比,Btbd7mRNA和DsppmRNA的表達(dá)水平均明顯降低(P0.05),Btbd7和Dspp蛋白的表達(dá)水平也明顯降低(P0.05)。3.CCK-8增殖活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA-Btbd7與siRNA-Ncontrol對照組相比,hDPCs顯著增殖。這表明Btbd7對hDPCs增殖有抑制作用。結(jié)論實(shí)驗(yàn)表明,在大鼠牙髓組織中存在Btbd7基因。在體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞當(dāng)中同樣也存在著Btbd7基因。siRNA沉默Btbd7基因后hDPCs增殖活性顯著增強(qiáng)。由此可見,Btbd7在hDPCs中具有調(diào)控其細(xì)胞增殖的作用。在沉默Btbd7基因后,hDPCs中Dspp的表達(dá)也顯著降低。這表明Btbd7可能通過調(diào)節(jié)Dspp的表達(dá)而參與牙本質(zhì)的形成和再生,對牙齒的生長發(fā)育和礦化發(fā)揮影響作用。本研究為牙本質(zhì)發(fā)育不全綜合征等涉及到牙本質(zhì)形成和礦化相關(guān)遺傳性疾病的治療提供了一定的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R78
【部分圖文】：

牙胚,發(fā)育情況,大鼠

３實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑ＨＥ染色：：幼鼠出生后５天，牙胚處于鐘狀期晚期，磨牙冠部牙本質(zhì)部分形成，逡逑牙頸部形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，但上皮根鞘結(jié)構(gòu)不明顯，牙根尚未開始發(fā)育（圖１）；第逡逑８天，磨牙冠部基本發(fā)育完成，根部開始發(fā)育，內(nèi)、外釉上皮在頸環(huán)處增生，可逡逑以見到上皮根鞘結(jié)構(gòu)（圖２）；第１１天，磨牙冠部發(fā)育進(jìn)一步完善，根部上皮逡逑根鞘繼續(xù)生長，牙本質(zhì)繼續(xù)發(fā)育，開始形成上皮隔（圖３）；第１５天，磨牙冠逡逑部發(fā)育完成，根部發(fā)育完成一半，可以見到根分叉結(jié)構(gòu)（圖４）；第１９天，磨逡逑牙牙根基本形成，并繼續(xù)生長（圖５）。逡逑免疫組化染色：在Ｗｉｓｔａｒ大鼠的牙髓組織當(dāng)中，可以觀察到Ｂｔｂｄ７陽性表達(dá)（圖逡逑６－１０），染色主要位于成牙本質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上。逡逑馨＿＿邋＆替逡逑圖１大鼠牙胚第５天發(fā)育情況（Ｘ２００）圖２大鼠牙胚第８天發(fā)育情況０２００）逡逑２０逡逑

大鼠,牙髓,牙胚,發(fā)育情況