發(fā)布時(shí)間：2020-09-17 10:00

　　 【目的】獲得蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)序列,了解其序列特征和組織表達(dá)特征,分析蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)的多態(tài)性�！痉椒ā恳蕴K淮豬卵巢組織c DNA為模板,采用克隆測(cè)序技術(shù)分離獲得蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)序列。利用Bio Edit 7.0軟件分析其序列特征和蛋白理化性質(zhì)。利用Clustal W軟件進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析。利用UCSC基因組瀏覽器與NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行豬VRTN基因的染色體定位和基因組結(jié)構(gòu)分析。利用SMART軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能域,CPHmodels軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。隨機(jī)選取3頭成年蘇淮豬母豬,屠宰后立即采集心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、肌肉和卵巢等組織,提取組織總RNA,采用RT-PCR技術(shù)分析蘇淮豬VRTN基因的組織表達(dá)譜。采集106頭成年蘇淮豬繁殖母豬耳組織樣,提取基因組DNA,采用PCR-凝膠電泳分析蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)的多態(tài)性�！窘Y(jié)果】蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為2 097bp,與其它哺乳動(dòng)物如人、小鼠、牛和羊的一致性分別為84.98%、74.53%、85.84%和86.45%,而與雞的一致性只有54.42%�；蚪M結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)豬VRTN基因由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成,定位在豬7號(hào)染色體上。蘇淮豬VRTN基因編碼蛋白含有698個(gè)氨基酸殘基,與人、小鼠、牛和羊等的一致性分別為85.55%、70.07%、86.20%和86.06%,但與雞的一致性只有51.17%,可見(jiàn)哺乳動(dòng)物VRTN基因在進(jìn)化過(guò)程中比較保守。氨基酸組分分析顯示蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列存在全部20種氨基酸,其中Leu(亮氨酸)含量最高,達(dá)到10.44%,而Asp天冬氨酸含量最低,只有1.43%。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)蘇淮豬VRTN蛋白含有HTH結(jié)構(gòu)域等典型結(jié)構(gòu)域,由6個(gè)α螺旋、5個(gè)β折疊以及若干無(wú)規(guī)則卷曲組成。RT-PCR分析表明VRTN基因在蘇淮豬心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、卵巢和肌肉組織等組織中均有表達(dá),說(shuō)明VRTN基因是一個(gè)廣泛表達(dá)的基因。在蘇淮豬群體中檢測(cè)到VRTN基因ins291位點(diǎn)的3種基因型,其中僅有93bp條帶的為野生純合型(wt/wt),僅有384bp條帶的為突變純合型(Q/Q),含有384和93bp條帶的為雜合型(wt/Q)。在蘇淮豬群體中wt/wt型為優(yōu)勢(shì)基因型,基因型頻率為0.717;wt為優(yōu)勢(shì)等位基因,基因頻率是0.816;高脊椎數(shù)等位基因Q的頻率為0.184。遺傳多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)的多態(tài)信息含量為0.331,為中度多態(tài)位點(diǎn),雜合度為0.40,變異程度相對(duì)較低�！窘Y(jié)論】獲得了蘇淮豬VRTN基因序列,其表達(dá)無(wú)組織特異性;蘇淮豬群體中存在高脊椎數(shù)等位基因Q。
【部分圖文】：

3642中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)49卷?xiàng)l帶大小對(duì)蘇淮豬不同個(gè)體VRTN基因ins291位點(diǎn)進(jìn)行分型。多態(tài)信息含量和雜合度等的計(jì)算方法見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。2結(jié)果2.1蘇淮豬VRTN基因PCR擴(kuò)增以蘇淮豬肌肉組織cDNA為模板，利用引物P1與P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到特異性良好且與目的片段大小一致的擴(kuò)增片段（圖1）。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為1328和898bp，與引物設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)期長(zhǎng)度一致。2.2蘇淮豬VRTN基因編碼區(qū)序列分析通過(guò)克隆測(cè)序和序列拼接獲得了蘇淮豬VRTN基因完整的編碼區(qū)序列，序列長(zhǎng)度為2097bp（圖2）。M：2000bpmarker；1-2：P1擴(kuò)增產(chǎn)物；3-4：P2擴(kuò)增產(chǎn)物M:2000bpmarker,1-2:P1amplificationproduct,3-4:P2amplificationproduct圖1蘇淮豬VRTN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1AgarosegelphotographofVRTNgeneinSuhuaipig1531511162154117115711801601189163119816612071691901301991331108136111713911261421135145114414812719136112145115154118163121172124181127119131181611圖2蘇淮豬VRTN基因核苷酸序列與預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.2NucleotideandaminoacidsequenceofVRTNgeneinSuhuaipig

哺乳動(dòng)物如人、倭黑猩猩、小鼠、大鼠、牛和羊的一致性分別為84.98%、85.12%、74.53%、73.68%、85.84%和86.45%，而與雞的一致性只有54.42%。哺乳動(dòng)物相近物種間VRTN基因編碼區(qū)核苷酸序列的一致性更高，如人和倭黑猩猩（99.38%）、牛和羊（96.48%）。電子染色體定位發(fā)現(xiàn)VRTN基因定位在豬7號(hào)染色體上，介于AbcD4基因（XM_013989158.1）與SYNDIG1L基因（XM_013989161.1）之間�；蚪M結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)豬VRTN基因由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。2.3蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列分析蘇淮豬VRTN基因編碼蛋白含有698個(gè)氨基酸殘基（圖3）。氨基酸組分分析顯示蘇淮豬VRTN蛋白SuhuaipigHumanRatMouseCattleSheepSuhuaipigHumanRatMouseCattleSheepSuhuaipigHumanRatMouseCattleSheepSuhuaipigHumanRatMouseCattleSheepSuhuaipigHumanRatMouseCattleSheepSuhuaipigHumanRatMouseCattleSheepSuhuaipigHumanRatMouseCattleSheepSuhuaipigHumanRatMouseCattleSheep10010010010010066200200200200200165300299299299293268389394398398382347485490497497479444573577596596567532626630682682624589697701763763699664LCRLCRHTHdomainInternalrepeatInternalrepeat黑色背景表示氨基酸殘基完全相同，灰色背景表示氨基酸殘基相似性較高Blackboxesindicatepositionsatwhichtheresiduesareidentical.Greyboxeshighlightresiduesthataresimilar圖3蘇淮豬VRTN基因氨基酸序列與其他哺乳動(dòng)物的同源性比較Fig.3IdenticalalignmentsofVRTNaminoacidsequenceinSuhuaipigwithothe

Edit軟件分析發(fā)現(xiàn)在蘇淮豬VRTN蛋白270—320、400—450、550—600氨基酸之間有3個(gè)較強(qiáng)的親水性區(qū)域，說(shuō)明蘇淮豬VRTN蛋白具有較強(qiáng)的親水性。NCBI與SMART在線軟件對(duì)VRTN蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果并未在蘇淮豬VRTN蛋白上發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，但發(fā)現(xiàn)蘇淮豬VRTN蛋白氨基酸序列存在2個(gè)低復(fù)雜區(qū)域（LCR）（5Glu—20Glu；247Glu—275Ser）和2個(gè)內(nèi)部重復(fù)序列（RPT）（291Val—436Arg；530Ser—687Ala），另外檢測(cè)到一個(gè)HTH結(jié)構(gòu)域（276Gln—306Glu）（圖3）。利用CPHmodels在線工具進(jìn)行蘇淮豬VRTN蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出VRTN蛋白包含6個(gè)α螺旋、5個(gè)β折疊以及若干無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。2.5蘇淮豬中VRTN基因組織表達(dá)譜分析以蘇淮豬各個(gè)組織cDNA為模板，利用引物P3與P4進(jìn)行RT-PCR分析，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖5�？梢钥闯�，在蘇淮豬心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、卵巢和肌肉等組織中均檢測(cè)到VRTN基因的表達(dá)，說(shuō)明VRTN基因是一個(gè)廣泛表達(dá)的基因。2.6蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)多態(tài)性分析在蘇淮豬群體中檢測(cè)到VRTN基因ins291位點(diǎn)的3種基因型（圖6），其中僅有93bp條帶的為野生純合型（wt/wt），僅有384bp條帶的為突變純合型（Q/Q），含有384和93bp條帶的為雜合型（wt/Q）。蘇淮豬VRTN基因ins291位點(diǎn)的基因型頻率、基因頻率分無(wú)規(guī)卷曲Randomcoilα-螺旋α-helixβ-折疊β-sheetN-末端N-terminalC-末端C-terminal圖4蘇淮豬VRTN蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4SpacestructurepredictionanalysisofVRTNproteininSuhuaipigM12345678GAPDHVRTNM：2000bpmarker；1：心；2：肝；3：脾；4：肺；5：腎；6：下丘腦；7：肌肉；8：卵巢M:2000bpmarker;1:Heart;2:Liver;3:Spleen;4:Lung;5:Kidney;6:Hypotha

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本文編號(hào)：2820573