葡萄是世界性栽培的主要果樹之一,不僅用途廣泛,還具有良好的經(jīng)濟效益。生產(chǎn)上主栽品種歐洲葡萄高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)風味佳,但其突出缺點是易感病,尤其是葡萄白粉病。葡萄中的白藜蘆醇及其衍生物,在葡萄體內(nèi)具有植保素的抗病功能,人食用后對身體健康具有抗癌、抗氧化和抗衰老等保健功能。因此,研究葡萄芪合成酶基因及其表達產(chǎn)物白藜蘆醇的作用,是近年來研究者提高與改良釀酒和鮮食品種抗病性與品質(zhì)的重要科學問題之一。本研究以中國野生葡萄種質(zhì)為材料進一步分析了自然條件下芪合成酶組織水平和亞細胞水平表達特點;分析調(diào)控葡萄芪合成酶基因表達的信號途徑和關(guān)鍵節(jié)點基因功能;研究誘導條件下芪合成酶及其產(chǎn)物合成、轉(zhuǎn)運、降解和作用方式;研究芪類物質(zhì)抗葡萄白粉病的作用,為利用中國野生葡萄的抗病性與芪合成酶基因改良歐洲葡萄抗病性提供依據(jù),主要研究與結(jié)果如下:(1)中國野生華東葡萄芪合成酶基因VpSTS29及芪類物質(zhì)呈現(xiàn)組織特異性表達。芪合成酶基因STS29在華東葡萄‘白河-35-1’和歐洲葡萄無核白的成熟葉片、毛葡萄‘丹鳳-2’成熟果實中高表達。芪合成酶VpSTS29在轉(zhuǎn)基因葡萄株系的根和成熟葉片中積累。芪合成酶表達的產(chǎn)物白藜蘆醇及白藜蘆醇苷主要分布在根、莖和成熟葉片中。在轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中芪合成酶VpSTS29及白藜蘆醇苷積累在成熟的葉片中,并在發(fā)育進程維持較高水平的葉綠素含量和光化學效率以延遲植株衰老。(2)芪合成酶基因VpSTS29受生物與非生物脅迫誘導表達。中國野生華東葡萄‘白河35-1’在接種白粉菌后48 h至72 h和144 h,芪合成酶基因VpSTS29表達量較高。在其他生物小分子SA、ABA、MeJA和Ethylene、非生物類因子高鹽、干旱、創(chuàng)傷、低溫和UV-C光等脅迫處理條件下,VpSTS29基因均上調(diào)表達。此外,UV-C光處理誘導芪合成酶基因VpSTS29顯著表達。進一步研究表明UV-C輻射誘導VpSTS29蛋白表達和芪類物質(zhì)合成,且發(fā)現(xiàn)從細胞質(zhì)向葉綠體遷移的現(xiàn)象。表型觀察表明轉(zhuǎn)基因無核白增強了對UV-C輻射的敏感性:葉片表現(xiàn)出干枯和燒焦狀且降低H_2O_2的含量。定量RT-PCR分析表明VpSTS29轉(zhuǎn)基因無核白改變了響應氧化還原、芪類物質(zhì)合成和光脅迫相關(guān)基因的表達。擬南芥原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化實驗表明過表達芪合成酶基因VpSTS29也能降低細胞內(nèi)部H_2O_2的含量。這些結(jié)果說明芪合成酶受環(huán)境脅迫誘導與表達,在細胞器間存在動態(tài)分布,并促進芪類物質(zhì)的積累。綜上芪合成酶基因VpSTS29既受生物脅迫誘導表達,又受非生物脅迫誘導表達。因此,該基因在葡萄生長發(fā)育過程中起到抗病與積極適應逆境脅迫的作用。(3)交叉嫁接實驗結(jié)果表明芪合成酶VpSTS29蛋白不存在組織間的運輸;在砧木過表達芪合成酶基因VpSTS29能顯著提高接穗芪類物質(zhì)含量。原位熒光觀察結(jié)果表明VpSTS29蛋白主要分布在根尖分生區(qū)、莖的維管組織以及葉片的葉肉組織。亞細胞定位分析表明芪合成酶VpSTS29定位于細胞質(zhì)以及球狀體胞器。尼羅紅染色、胞器標記基因共定位以及免疫組化分析證實該球狀體為油體,且在特定發(fā)育階段這些油體游離在細胞質(zhì)和液泡中。蛋白表達模式分析證實定位于細胞質(zhì)、油體和液泡中的綠色熒光為VpSTS29-GFP融合蛋白。共定位和抑制試驗結(jié)果表明油體定位的VpSTS29是通過自噬途徑轉(zhuǎn)運至液泡的。綜上在葡萄體內(nèi)芪合成酶VpSTS29經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的油體通過自噬途徑轉(zhuǎn)運至液泡中。芪合成酶及其產(chǎn)物在合成后存在動態(tài)再分配,以滿足植物生長發(fā)育的需要。(4)RT-PCR分析表明在白粉菌接種后24 h至48 h轉(zhuǎn)基因葡萄芪合成酶基因表達強度顯著高于非轉(zhuǎn)基因葡萄,芪合成酶基因VpSTS29改變了感病葡萄無核白內(nèi)源芪合成酶基因及病程相關(guān)蛋白基因?qū)Π追劬肭值膽饡r間以及表達強度。通過大麥凝集素染色、基因槍轟擊、原位熒光觀察以及免疫印跡分析證明了轉(zhuǎn)基因葡萄中芪合成酶VpSTS29是通過增強葉肉組織的表達以及合成有活性的葡萄素積累在侵入位點,進一步抑制病原菌入侵。在不含有芪合成酶基因的模式植物擬南芥中轉(zhuǎn)入VpSTS29基因,轉(zhuǎn)基因擬南芥積累VpSTS29蛋白和白藜蘆醇苷,表現(xiàn)出抑制菌絲生長、局部發(fā)生過敏反應以及降低病原菌侵入率。外源施加水楊酸SA和白藜蘆醇均能促進VpSTS29蛋白的表達和trans-piceid的累積。SA信號途徑與白藜蘆醇合成途徑在病原菌防御中密不可分。這些結(jié)果表明,芪合成酶基因表達及芪類物質(zhì)積累增強轉(zhuǎn)基因VpSTS29歐洲葡萄無核白和擬南芥對白粉病抗性。(5)R2R3類型轉(zhuǎn)錄因子MYB14和MYB15在中國野生葡萄和歐洲葡萄中氨基酸序列較為保守,且直接結(jié)合芪合成酶基因VpSTS29的啟動子。此外,通過中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’果實發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定了調(diào)控芪合成酶基因表達的bHLH類型的轉(zhuǎn)錄因子基因VqICE1。共表達分析表明VqICE1與26個芪合成酶基因存在表達相關(guān)性。酵母單雜交實驗表明VqICE1能結(jié)合group-B亞家族的芪合成酶基因VqSTS15、VqSTS27和VqSTS48啟動子區(qū)域,且降低這些芪合成酶基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。而VqMYB14和VqMYB15正調(diào)控這些芪合成酶基因啟動子活性。VqICE1可與VqMYB14和VqMYB15在細胞核中相互作用,并直接結(jié)合VqMYB14啟動子,降低VqMYB14的表達和trans-piceid的積累。白粉菌誘導條件下,野生型無核白葡萄中芪合成酶基因整體水平、MYB14和MYB15受誘導表達;過表達VqICE1降低了白粉菌侵染后期芪合成酶基因整體水平和MYB14的表達。這些結(jié)果表明VqICE1負調(diào)控芪合成酶基因的表達,以維持抗病作用后芪類物質(zhì)含量恢復到正常水平。綜上所述,芪合成酶基因VpSTS29及芪類物質(zhì)呈現(xiàn)組織特異性,且受生物與非生物逆境脅迫誘導表達;芪合成酶及其產(chǎn)物在植物特定生長發(fā)育階段通過自噬途徑轉(zhuǎn)運至液泡儲藏;芪類物質(zhì)在白粉菌誘導條件下迅速合成與積累,在病菌侵入位點參與抗病;此外,芪合成酶基因行使抗病功能后受轉(zhuǎn)錄因子基因調(diào)控。所以,芪合成酶基因VpSTS29具有增強葡萄中芪類物質(zhì)積累與抗病性的作用。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S436.631
【部分圖文】：

圖 1-1 苯丙氨酸途徑與白藜蘆醇合成途徑(Vannozzi et al. 2012neral phenylpropanoid pathway and stilbene branching pathway (Vann年來，研究者已經(jīng)在葡萄科及葡萄制品中鑒定出至少四大類質(zhì)。白藜蘆醇不具有很高的抑菌活性(Adrian et al. 1997)，但侵時作為前體分子可以轉(zhuǎn)化成具有較高生物活性的紫檀芪原菌進一步入侵。雖然白藜蘆醇作為最基本單位可以轉(zhuǎn)化成，但白藜蘆醇在植物體內(nèi)的降解機制尚未研究。研究表明maydis）、黃曲霉（Aspergillus fumigatus），球毛殼菌（Cha和富克爾核盤菌（Botryotinia fuckeliana）等微生物中存在一蘆醇的酶，命名為 Resveratrol cleavage oxygenase (Rco) (Bre能斷裂白藜蘆醇分子兩個苯環(huán)間的 C -Cβ雙鍵，生成 3，羥基苯甲醛(Brefort et al. 2011)。除了向其他形式的衍生物轉(zhuǎn)萄體內(nèi)積累較低水平的白藜蘆醇，可能也與此有關(guān)。白藜蘆醇及其衍 物的檢測

聚類分析結(jié)果表明 VpSTS29 與 VvSTS27、VvSTS29 同源（圖2-1）。氨基酸序列比對結(jié)果表明這些芪合成酶均編碼 392 個氨基酸，同源性為99.32%，且 VpSTS29 在芪合成酶特征序列存在 Ser/Phe 點突變（圖 2-2A）。RT-PCR 分析結(jié)果表明芪合成酶基因 VpSTS29 在華東葡萄‘白河-35-1’的根和基部葉片（14th）表達量最高，其次是位于第 6th節(jié)位葉片和嫩莖，最低是頂部葉片（2nd）（圖 2-2B）。這一結(jié)果與大部分芪合成酶基因表達趨勢一致。因此芪合成酶基因 VpSTS29 可以作為典型候選基因研究中國野生葡萄芪合成酶基因功能。此外，芪合成酶基因 VpSTS29 在華東葡萄‘白河-35-1’接種后 48 h 至 72 h 以及120 h 至 144 h 極顯著上調(diào)表達（圖 2-2C）。

圖 2-2 芪合成酶基因 VpSTS29 序列比對與表達特性分析。A，VpSTS29 氨基酸序列比對。B，芪合成酶基因 VpSTS29 在中國野生華東葡萄‘白河-35-1’不同組織表達分析。取生長至15 片葉時的‘白河-35-1’組培苗的根、莖和不同節(jié)位葉片（2nd、6th和 14th，頂部定義為 1st）等組織進行定量 RT-PCR 分析。C，葡萄白粉菌接種條件下芪合成酶基因 VpSTS29 表達分析。采用壓片法接種華東葡萄‘白河-35-1’第 4-6 節(jié)位、生長狀態(tài)一致的葉片。分別采集接種后 1-7 天樣品進行 RT-PCR 分析。無菌水處理的 mock 作為對照。葡萄 actin 作為內(nèi)參基因。采用最小顯著法 least signifcant diference (LSD)進行數(shù)據(jù)顯著性分析(**P < 0.01，*P <0.05)。標準差取自三個生物學重復。Figure 2-2 The sequence alignment and expression of VpSTS29 in different tissues and under U.necator inoculation. A, The sequence alignment of VpSTS29. B, The expression of VpSTS29 indifferent tissues. Samples including root, stem and leaves in different positions (2nd, 6thand 14th)were collected from leaves of V. pseudoreticulata accession Baihe-35-1 plantlet for the RT-PCRanalysis. the base was defned as the 1st leaf and the apex was defned as the 15th leaf. C, Theexpression of VpSTS29 induced by U. necator inoculation. The 4thto 6thleaves with the samegrowth status from V. pseudoreticulata accession Baihe-35-1 were inoculated with U. necator.

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本文編號：2813564