【摘要】：目的:在植物脂肪酸合成代謝過程中,Δ12脂肪酸去飽和酶基因FAD2是控制油酸脫氫合成亞油酸的關(guān)鍵酶基因。在油料作物中,油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)是種子油脂中的主要脂肪酸組分,其在油料作物種子中的相對比例決定了食用植物油的營養(yǎng)價(jià)值與氧化穩(wěn)定性。棉花既是最重要的纖維作物,又是重要的油料作物�？寺∶拮阎刑禺惛咝П磉_(dá)的FAD2基因,并對其深入研究,有利于采用脂肪酸代謝基因工程技術(shù)對棉仁中脂肪酸成分進(jìn)行定向修飾和改造。方法:(1)在已知GhFAD2氨基酸序列(GenBank X97016)的基礎(chǔ)上,從棉花基因組數(shù)據(jù)庫中電子克隆獲得GhFAD2家族基因,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;(2)利用qRT-PCR技術(shù)分析GhFAD2基因家族在棉花不同組織和種子不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)特性;(3)利用索氏提取法(石油醚法)提取不同發(fā)育時(shí)期棉籽中的總油脂,并通過GC-MS測定花后5-60天(DPA)的12個(gè)不同發(fā)育階段棉籽的樣品,分析棉籽中特異高效表達(dá)的GhFAD2在棉籽不同發(fā)育時(shí)期中mRNA表達(dá)水平與C18:1/C18:2比值;(4)用波通近紅外掃描儀無損傷測定566份陸地棉品種(系),篩選出高(20%)、中(17%-19%)、低(11%-16%)油份的棉花材料,進(jìn)而測定其各脂肪酸組分的相對含量,分析GhFAD2表達(dá)水平(油酸/亞油酸的相對比例)與棉籽的油脂含量的相關(guān)性。(5)通過同源技術(shù)克隆獲得棉籽中特異高效表達(dá)的GhFAD2-1,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建35HK-GhFAD2-1植物干擾表達(dá)載體,用DNA重組技術(shù)構(gòu)建pBI121-GhFAD2-1植物超表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥和新陸早33號,分析GhFAD2-1的功能。結(jié)果與結(jié)論:1.利用生物信息學(xué)方法,從棉花基因組數(shù)據(jù)庫中電子克隆獲得GhFAD2家族基因。GhFAD2基因在A基因組和D基因組中均有4個(gè)拷貝,分別命名為GhFAD2-1A、GhFAD2-1D、GhFAD2-2A、GhFAD2-2D、GhFAD2-3A、GhFAD2-3D、GhFAD2-4A、GhFAD2-4D。通過序列分析可知,GhFAD2基因編碼區(qū)連續(xù)均無內(nèi)含子序列,棉花的同一FAD2基因在A基因組與D基因組的序列高度一致。2.qRT-PCR結(jié)果表明,GhFAD2-1/2/3/4基因在不同組織中都存在差異,GhFAD2-1基因在發(fā)育中的種子中特異高效表達(dá),而在其它組織中表達(dá)量很低。GhFAD2-2基因在陸地棉各組織中都有表達(dá),但表達(dá)量很低。GhFAD2-3和GhFAD2-4基因同源性高達(dá)98.44%,在所有組織中均有表達(dá),包括根、莖、葉片、花和種子。3.利用qRT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)GhFAD2-1基因在棉籽發(fā)育呈先升高后降低的趨勢,40DPA是其表達(dá)峰值。使用GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定其脂肪酸組成,結(jié)果分析表明油酸/亞油酸比值與FAD2-1基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。通過對陸地棉材料脂肪酸組分分析發(fā)現(xiàn),種子含油量與棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸等脂肪酸的相對百分含量沒有顯著相關(guān)性。GhFAD2-1基因在種子中的表達(dá)水平?jīng)Q定了油酸/亞油酸的相對比例,但與棉籽的油脂含量并沒有明顯的相關(guān)性。4.采用同源克隆技術(shù)獲得了棉花品種“新陸早33號”的GhFAD2-1基因。該基因編碼區(qū)全長1158bp,共編碼385個(gè)氨基酸。將構(gòu)建的35HK-GhFAD2-1干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化模式植物野生型擬南芥,超表達(dá)載體pBI121-GhFAD2-1轉(zhuǎn)化fad2突變體擬南芥(CS8041),篩選獲得GhFAD2-1轉(zhuǎn)基因的純合體。超表達(dá)轉(zhuǎn)化突變體基因株系中油酸的含量有所降低,并且亞油酸的含量增加。而GhFAD2-1基因在野生型擬南芥中干擾表達(dá)抑制了擬南芥內(nèi)源FAD2-1基因的表達(dá),因此表現(xiàn)為同突變體相似的性狀。5.將已構(gòu)建的pBI121-GhFAD2-1超表達(dá)載體,干擾載體35HK-GhFAD2-1通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染棉花新陸早33號下胚軸,獲得棉花陽性植株,為進(jìn)一步在分子水平上研究GhFAD2-1的表達(dá)與調(diào)控機(jī)制,進(jìn)而為棉籽油的品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S562
【圖文】：

棉花 GhFAD2 基因的克隆及功能分析 首先被運(yùn)送到質(zhì)體中，經(jīng)過脂肪酸合酶（Fatty acid synthase）縮合、還原、脫進(jìn)行碳鏈延伸；然后在硫酯酶的作用下，合成脂酰基并從�；d體蛋白（Acyl Cin，ACP）上釋放出來；FA 被運(yùn)送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER），甘油（3－phosphoglycerate）縮合成 TAG 最后，新和成的 TAG 被運(yùn)輸至油體鏡巖等，2004）。 棉籽油酯組分與基因的關(guān)系

圖 1-2 FAD2 的基本特性Fig. 1-2 The basic features of FAD2A FAD2 催化油酸脫氫合成；B FAD2 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；C FAD2 定位于質(zhì)體膜A FAD2 catalyzes the dehydrogenation of oleic acid; B FAD2 is positioned on the endoplasmic reticulum; C FAD2 ispositioned on the plastid membrane1.2.2Δ12 脂肪酸去飽和酶的結(jié)構(gòu)及特性油酸脫飽和酶，共 458 個(gè)氨基酸，其對應(yīng)的蛋白質(zhì)約為 52kDa，與其他的去飽和酶相比較有保守的三個(gè)組氨酸box以及膜結(jié)合酶特性的疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域，N端區(qū)域約100個(gè)氨基酸。N-末端測序發(fā)現(xiàn)富集的重組蛋白，具有植物微粒體細(xì)胞色素 B5 的氧化還原吸收光譜特征（Sperling P，1995）。Δ12 �；|(zhì)脫氫酶在大腸桿菌中超表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)蛋白與細(xì)胞膜有關(guān)，約占細(xì)胞總蛋白的 10%，占總膜蛋白的 25%（Panpoom S，1998）。哺乳動物 FAD2 家族的基因組結(jié)構(gòu)分為三個(gè)亞型，F(xiàn)ADS1、FADS2、 FADS3。然后我們研究了豬 FADS1 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并鑒定了一種新的基因亞型，命名為 FADS1b。進(jìn)化

圖 1-3 亞油酸合成花生四烯酸Fig.1-3 Linoleic acid synthesis of Arachidonate.轉(zhuǎn)運(yùn)血漿中疏水的脂肪。血液中循環(huán)利用的脂蛋白脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)和 HDL(高密度脂蛋白形成過程中由 VLDL 衍生而來的。脂肪酸是細(xì)胞內(nèi)的儲存于脂肪組織中。用于貯存脂肪的脂肪酸主要以形式被轉(zhuǎn)運(yùn)入脂肪組織。乳糜微粒在脂肪組織中被環(huán)中，被肝臟吸收。VLDL 在脂肪組織中被降解成醇的脂蛋白而循環(huán)。HDI.是可被不斷循環(huán)利用的脂為膽固醇酯的磷脂酰膽堿膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(或卵磷l Keys 等在馬德里進(jìn)行的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，40-49 歲的們的總脂肪攝入(主要是單不飽和脂肪酸)占每日總能牙并不常見（Ancel Keys et al，1953）。研究發(fā)現(xiàn)，增加膳食攝入單不飽和脂肪酸 OA,能降低

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2804748