發(fā)布時間：2020-08-20 21:16

【摘要】：癌癥正逐漸成為威脅人類健康的一大隱患,其傳統(tǒng)治療方式主要是手術(shù)以及放化療。這些治療方法雖然挽救了無數(shù)生命,但也面臨著手術(shù)禁忌癥、預(yù)后不良等多種挑戰(zhàn),因此癌癥治療新方法仍是亟待探索研究的重要領(lǐng)域。近年來,高效精準(zhǔn)的基因治療方法在腫瘤治療中正發(fā)揮著重要的作用。因此,本課題設(shè)計了一種適配體和DNA酶共同作用的多功能DNA納米蝎的納米結(jié)構(gòu)(稱為AptDzy-DNS),用于在腫瘤細(xì)胞中高效靶向遞送并進(jìn)行基因治療。設(shè)計自組裝的納米蝎其功能類似于“蝎子”,它的頭部包含了特定的適配體形成“蝎刺”,通過與細(xì)胞表面的適配體受體特異性結(jié)合從而靶向識別腫瘤細(xì)胞,兩臂末端的DNA酶形成“蝎鉗”,在Mg~(2+)的協(xié)助下,完成對靶mRNA的剪切。在基因沉默過程中,剪切后的mRNA不能完成相應(yīng)的蛋白質(zhì)翻譯,阻止癌細(xì)胞生長從而實現(xiàn)基因沉默。結(jié)果表明,多功能納米蝎不僅能完成對SK-BR-3和MDA-MB-231兩種乳腺癌細(xì)胞的特異性識別,而且通過RT-PCR和Western blot試驗中,mRNA含量的降低及蛋白表達(dá)量的減少顯示了對靶向腫瘤細(xì)胞的治療作用。因此,本研究為腫瘤細(xì)胞靶向治療提供了新思路,也顯示了納米蝎在人類癌癥靶向治療中的極大應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730.5
【圖文】：

11圖 1 (A)自組裝的納米蝎, (B) 納米蝎靶向傳遞過程, (C) 納米蝎介導(dǎo)的基因治療示意圖Fig. 1 (A) Assembly of AptDzy-DNS (B) Targeted delivery methods. (C) Schematicillustration of AptDzy-DNS mediated highly efficient gene therapy.2.2 多功能納米蝎的表征本次實驗所使用的多功能納米蝎的合成是在此前工作的基礎(chǔ)上改良所得[36]。我們首先用到了 6%的聚苯稀酰胺凝膠電泳（PAGE）以驗證十條核苷酸鏈?zhǔn)欠癯晒M裝（圖 2A）。在圖 2A 泳道 1 大于 200 個堿基對的位置可以看到一條明亮干凈的條帶，指示完整納米蝎（包括核苷酸鏈 1-9 和設(shè)定鏈 10）的成功合成。同時，在圖 2A 泳道 2 大于 200 個堿基對的位置也出現(xiàn)了一條明亮干凈的條帶，這個混合物只加入了核苷酸鏈 1-9，并無設(shè)定鏈，由于含更少的堿基對，該條帶比泳道 1 條

圖 2 納米蝎自組裝的表征。（A）納米蝎自組裝的 PAGE 電泳分析。 左側(cè)為 DNA 標(biāo)記，泳道1-2 代表關(guān)閉狀態(tài)的納米蝎和打開狀態(tài)的納米蝎。 （B）納米蝎的 AFM 圖像。 相位圖像，比例尺為 300 納米。Fig. 2 Characterization of AptDzy-DNS self-assembly. (A) PAGE analysis of AptDzy-DNSself-assembly. Lanes 1-2 represent closed AptDzy-DNS and opened AptDzy-DNS, and Mrepresents DNA ladder marker. (B) AFM image of AptDzy-DNS. Phase image, the scale bar is300 nm.2.3 細(xì)胞外納米蝎剪切活性的可行性分析組裝好的納米蝎與合成的靶序列 HER2 mRNA 于緩沖液中混合后，通過熒光實驗來驗證納米蝎兩臂的 DNA 酶對 HER2 mRNA 的剪切效果。此處， HER2mRNA 的 5'端和 3'端分別標(biāo)記了熒光基團(tuán)（FITC）和淬滅基團(tuán)（BHQ1）（圖 3A）。圖 3A 中, 在 HER2 mRNA 存在時, 納米蝎的兩臂末端能與 HER2 mRNA 雜交形2+

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文熒光，如果沒有納米蝎與 HER2 mRNA 雜交，就沒有可觀測到的剪切后的熒光號（圖 3B）。圖 3C 中，我們也做了更有趣的實驗對比我們此前工作中[36]的兩種組裝結(jié)構(gòu)的納米蝎的剪切效果。我們驗證了打開狀態(tài)的納米蝎（包含核酸鏈 和設(shè)定鏈 10）和關(guān)閉狀態(tài)的納米蝎（只包含核酸鏈 1-9）對 HER2 mRNA 的剪效果，結(jié)果顯示打開狀態(tài)的納米蝎熒光強(qiáng)度更大，預(yù)示著這種結(jié)構(gòu)更有利于剪mRNA，所以實驗中均采用了這種打開狀態(tài)的納米蝎。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在使DNA 酶時，在兩臂使用兩種不同的 DNA 酶（DNA 酶 10-23 和 DNA 酶 8-17）在兩臂使用相同的 DNA 酶的效果更好。這個現(xiàn)象可能歸因于 DNA 酶 10-23 與 8-17 能提供更多的結(jié)合 mRNA 的位點，與 mRNA 的結(jié)合更加充分。

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本文編號：2798453