【摘要】：背景:心房顫動(dòng)(atrial fibrillation,AF),簡(jiǎn)稱(chēng)房顫,是臨床常見(jiàn)且具有嚴(yán)重危害的心房異位搏動(dòng),其頻率在350~600次/min。房顫的病因?qū)W研究表明,有部分房顫患者既沒(méi)有這些傳統(tǒng)意義上的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素,也沒(méi)有確定的病因;這種原因不明的心房顫動(dòng)被稱(chēng)為特發(fā)性房顫(Idiopathic atrial fibrillation,IAF)。IAF的患者常表現(xiàn)為家族聚集性,故而研究人員推測(cè)其發(fā)病機(jī)制可能與遺傳因素相關(guān)。KCNA5是一個(gè)房顫易感基因,該基因定位于人12號(hào)染色體12p13上,可編碼Kv1.5鉀離子通道的α亞單位。在人類(lèi)心臟中,Kv1.5特異性表達(dá)于心房肌細(xì)胞,并介導(dǎo)超速激活延遲整流鉀電流(ultra-rapid activated rectifier potassium currents,IKur)電流。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指出現(xiàn)在染色體DNA分子序列上某個(gè)特定位點(diǎn)的單個(gè)核苷酸的多態(tài)性,在一個(gè)群體中出現(xiàn)2個(gè)及以上的等位基因且基因頻率大于或等于百分之一時(shí)即可認(rèn)為具有多態(tài)性。目前關(guān)于Kv1.5鉀離子通道編碼基因KCNA5的分析研究在選擇樣本、個(gè)體條件上有許多差異,所得結(jié)果也不盡相同,相關(guān)研究仍然不足。本研究選取KCNA5基因外顯子上位于5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)的rs3741930(C/T)和位于3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)的rs1056468(A/T)位點(diǎn),通過(guò)基因測(cè)序、電生理技術(shù)等方法比較房顫患者和正常對(duì)照人群候選基因位點(diǎn)基因頻率與基因型的差異,研究KCNA5基因SNP多態(tài)性與房顫的相關(guān)關(guān)系,以期從分子生物學(xué)水平探討房顫風(fēng)險(xiǎn)基因的單核苷酸多態(tài)性是否存在群體差異性,為房顫的診斷和個(gè)性化治療提供新的潛在位點(diǎn)。第一部分IAF患者中KCNA5 SNP位點(diǎn)各等位基因頻率的分布情況目的:探討KCNA5基因上的兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs3741930(C/T)和rs1056468(A/T)等位基因與特發(fā)性房顫之間的關(guān)系。方法:收集了282例IAF患者作為研究對(duì)象,以300例年齡和性別匹配的健康人群作為對(duì)照組。每位受試者采集外周血5 mL。提取來(lái)自全血細(xì)胞的基因組DNA。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。進(jìn)行目的片段的鑒定、純化、回收及測(cè)序。統(tǒng)計(jì)分析房顫患者和正常健康人群中KCNA5 SNP位點(diǎn)等位基因頻率的分布情況。結(jié)果:rs3741930位點(diǎn)在特發(fā)性房顫組和正常健康組的遺傳學(xué)分布符合H-W平衡;SNP分型檢測(cè)的結(jié)果顯示rs3741930的等位位點(diǎn)C、T在特發(fā)性房顫組的分布頻率分別為(235)41.7%、(329)58.3%,在健康對(duì)照組的分布頻率分別為(208)34.7%、(392)65.3%;特發(fā)性房顫組rs3741930位點(diǎn)等位基因C的分布頻率顯著高于健康對(duì)照組(P=0.014)。rs1056468位點(diǎn)在特發(fā)性房顫組和正常健康組的遺傳學(xué)分布符合H-W平衡;SNP分型檢測(cè)的結(jié)果顯示rs3798579等位位點(diǎn)A、T在特發(fā)性房顫組的分布頻率分別為(387)68.6%、(177)31.4%,在健康對(duì)照組的分布頻率分別為(384)64%、(216)36%;兩組比較,rs1056468位點(diǎn)等位基因A的分布頻率在特發(fā)性房顫組和正常健康組中的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.095)。小結(jié):經(jīng)H-W遺傳學(xué)平衡定律檢測(cè),本研究所選樣本具有良好的群體代表性。KCNA5基因中SNP位點(diǎn)rs3741930可作為特發(fā)性房顫發(fā)病的一個(gè)新的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn),攜帶C等位基因的人群更易患房顫。rs1056468位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與特發(fā)性房顫之間無(wú)顯著聯(lián)系。第二部分IAF患者中KCNA5 SNP位點(diǎn)的各基因型頻率的分布情況目的:探討KCNA5基因上的兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs3741930(C/T)和rs1056468(A/T)基因型與特發(fā)性房顫之間的關(guān)系。方法:利用DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)IAF患者和健康對(duì)照人群中KCNA5基因SNP位點(diǎn)的各基因型分布頻率,并分析IAF患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)分別在兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs3741930和rs1056468的不同基因型之間是否存在差異。結(jié)果:rs3741930基因SNP多態(tài)性位點(diǎn)的三種基因型CC、CT、TT在特發(fā)性房顫組的分布頻率分別表現(xiàn)為(47)16.7%、(141)50.0%和(94)33.3%,健康組分別為(30)10%、(148)49.3%和(122)40.7%;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示純合子基因型CC分布頻率在兩組之間的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);CT、TT基因型分布頻率在二組之間的差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。rs1056468基因SNP多態(tài)性位點(diǎn)的三種基因型AA、AT、TT在特發(fā)性房顫的基因分布頻率分別表現(xiàn)為(125)44.3%、(137)48.6%和(20)7.1%,正常健康組則分別表現(xiàn)為(116)38.7%、(152)50.7%和(32)10.6%,三種基因型分布頻率在二組之間的差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。IAF患者的年齡、收縮壓、舒張壓、心室率、左心房?jī)?nèi)徑以及左室射血分?jǐn)?shù)等臨床指標(biāo)在rs3741930和rs1056468的不同基因型之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。多態(tài)位點(diǎn)rs3741930-CC基因型患者的體質(zhì)指數(shù)(BMI)為26.9±2.3 Kg/m~2,而多態(tài)位點(diǎn)rs3741930-CT+TT基因型患者的BMI為24.8±2.5 Kg/m~2,兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.019)。多態(tài)位點(diǎn)rs1056468-AA基因型患者的BMI為24.9±2.7 Kg/m~2,而多態(tài)位點(diǎn)rs1056468-AT+TT基因型患者的BMI為26.4±2.4 Kg/m~2,兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.014)。小結(jié):KCNA5基因中SNP位點(diǎn)rs3741930與特發(fā)性房顫存在相關(guān)性,攜帶CC基因型的人群更易患房顫。在IAF患者中KCNA基因多態(tài)位點(diǎn)rs3741930和rs1056468的不同基因型之間患者的體重指數(shù)存在差異。第三部分KCNA5基因SNP位點(diǎn)rs3741930等位基因C和T對(duì)Kv1.5電流的影響目的:制備異源表達(dá)體系,以進(jìn)一步驗(yàn)證KCNA5多態(tài)性位點(diǎn)rs3741930與特發(fā)性房顫之間的關(guān)系。方法:使用基因工程技術(shù)將含有rs3741930多態(tài)性位點(diǎn)的KCNA5基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中制備異源性表達(dá)體系,并使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)進(jìn)行Ikur測(cè)定,以評(píng)估rs3741930位點(diǎn)不同等位基因?qū)kur的影響。結(jié)果:全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示,rs3741930位點(diǎn)T等位基因組60mV處的Ikur的電流密度為45.36±7.79 pA/pF(n=13),而C等位基因組則降至為39.52±4.74 pA/pF(n=11),兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0416)。以+60mV的電流作為100%進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,觀測(cè)電流-電壓曲線(xiàn)的形態(tài),可發(fā)現(xiàn)兩種HEK293細(xì)胞的電流-電壓曲線(xiàn)的形態(tài)高度重合。小結(jié):Ikur的電壓依賴(lài)特性沒(méi)有發(fā)生轉(zhuǎn)變,C等位基因組中Ikur較T等位基因組減少的原因可能是細(xì)胞膜上KCNA5蛋白表達(dá)數(shù)目減少所致,而非蛋白鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變所致。結(jié)論:KCNA5基因中SNP位點(diǎn)rs3741930與特發(fā)性房顫存在相關(guān),攜帶攜帶C等位基因及CC基因型的人群更易患房顫。其主要原因可能是C等位基因組較T等位基因組細(xì)胞膜上KCNA5蛋白表達(dá)數(shù)目減少,Ikur降低。在IAF患者中KCNA5基因多態(tài)位點(diǎn)rs3741930和rs1056468的不同基因型之間患者的體重指數(shù)存在差異。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R541.75
【圖文】：

pMD18-T-KCNA5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中KCNA5基因的PCR擴(kuò)增

圖 3 pcDNA3.1-T2A-EGFP 表達(dá)載體圖譜g.3 The expression vector map of pcDNA3.1-T2The gene insertion site is marked with narrow.100μ m

pcDNA3.1-T2A-EGFP 表達(dá)載體xpression vector map of pcDNA3e insertion site is marked with na

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2790277