發(fā)布時間：2020-08-12 07:59

【摘要】：背景:心房顫動(atrial fibrillation,AF),簡稱房顫,是臨床常見且具有嚴重危害的心房異位搏動,其頻率在350~600次/min。房顫的病因學研究表明,有部分房顫患者既沒有這些傳統(tǒng)意義上的發(fā)病風險因素,也沒有確定的病因;這種原因不明的心房顫動被稱為特發(fā)性房顫(Idiopathic atrial fibrillation,IAF)。IAF的患者常表現(xiàn)為家族聚集性,故而研究人員推測其發(fā)病機制可能與遺傳因素相關。KCNA5是一個房顫易感基因,該基因定位于人12號染色體12p13上,可編碼Kv1.5鉀離子通道的α亞單位。在人類心臟中,Kv1.5特異性表達于心房肌細胞,并介導超速激活延遲整流鉀電流(ultra-rapid activated rectifier potassium currents,IKur)電流。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指出現(xiàn)在染色體DNA分子序列上某個特定位點的單個核苷酸的多態(tài)性,在一個群體中出現(xiàn)2個及以上的等位基因且基因頻率大于或等于百分之一時即可認為具有多態(tài)性。目前關于Kv1.5鉀離子通道編碼基因KCNA5的分析研究在選擇樣本、個體條件上有許多差異,所得結果也不盡相同,相關研究仍然不足。本研究選取KCNA5基因外顯子上位于5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)的rs3741930(C/T)和位于3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)的rs1056468(A/T)位點,通過基因測序、電生理技術等方法比較房顫患者和正常對照人群候選基因位點基因頻率與基因型的差異,研究KCNA5基因SNP多態(tài)性與房顫的相關關系,以期從分子生物學水平探討房顫風險基因的單核苷酸多態(tài)性是否存在群體差異性,為房顫的診斷和個性化治療提供新的潛在位點。第一部分IAF患者中KCNA5 SNP位點各等位基因頻率的分布情況目的:探討KCNA5基因上的兩個單核苷酸多態(tài)性位點rs3741930(C/T)和rs1056468(A/T)等位基因與特發(fā)性房顫之間的關系。方法:收集了282例IAF患者作為研究對象,以300例年齡和性別匹配的健康人群作為對照組。每位受試者采集外周血5 mL。提取來自全血細胞的基因組DNA。以基因組DNA為模板進行PCR擴增目的片段。進行目的片段的鑒定、純化、回收及測序。統(tǒng)計分析房顫患者和正常健康人群中KCNA5 SNP位點等位基因頻率的分布情況。結果:rs3741930位點在特發(fā)性房顫組和正常健康組的遺傳學分布符合H-W平衡;SNP分型檢測的結果顯示rs3741930的等位位點C、T在特發(fā)性房顫組的分布頻率分別為(235)41.7%、(329)58.3%,在健康對照組的分布頻率分別為(208)34.7%、(392)65.3%;特發(fā)性房顫組rs3741930位點等位基因C的分布頻率顯著高于健康對照組(P=0.014)。rs1056468位點在特發(fā)性房顫組和正常健康組的遺傳學分布符合H-W平衡;SNP分型檢測的結果顯示rs3798579等位位點A、T在特發(fā)性房顫組的分布頻率分別為(387)68.6%、(177)31.4%,在健康對照組的分布頻率分別為(384)64%、(216)36%;兩組比較,rs1056468位點等位基因A的分布頻率在特發(fā)性房顫組和正常健康組中的差異不具有統(tǒng)計學意義(P=0.095)。小結:經H-W遺傳學平衡定律檢測,本研究所選樣本具有良好的群體代表性。KCNA5基因中SNP位點rs3741930可作為特發(fā)性房顫發(fā)病的一個新的風險位點,攜帶C等位基因的人群更易患房顫。rs1056468位點的單核苷酸多態(tài)性與特發(fā)性房顫之間無顯著聯(lián)系。第二部分IAF患者中KCNA5 SNP位點的各基因型頻率的分布情況目的:探討KCNA5基因上的兩個單核苷酸多態(tài)性位點rs3741930(C/T)和rs1056468(A/T)基因型與特發(fā)性房顫之間的關系。方法:利用DNA測序技術檢測IAF患者和健康對照人群中KCNA5基因SNP位點的各基因型分布頻率,并分析IAF患者各項臨床指標分別在兩個多態(tài)性位點rs3741930和rs1056468的不同基因型之間是否存在差異。結果:rs3741930基因SNP多態(tài)性位點的三種基因型CC、CT、TT在特發(fā)性房顫組的分布頻率分別表現(xiàn)為(47)16.7%、(141)50.0%和(94)33.3%,健康組分別為(30)10%、(148)49.3%和(122)40.7%;統(tǒng)計學分析顯示純合子基因型CC分布頻率在兩組之間的分布具有統(tǒng)計學差異(P0.05);CT、TT基因型分布頻率在二組之間的差別不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。rs1056468基因SNP多態(tài)性位點的三種基因型AA、AT、TT在特發(fā)性房顫的基因分布頻率分別表現(xiàn)為(125)44.3%、(137)48.6%和(20)7.1%,正常健康組則分別表現(xiàn)為(116)38.7%、(152)50.7%和(32)10.6%,三種基因型分布頻率在二組之間的差別不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。IAF患者的年齡、收縮壓、舒張壓、心室率、左心房內徑以及左室射血分數(shù)等臨床指標在rs3741930和rs1056468的不同基因型之間的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。多態(tài)位點rs3741930-CC基因型患者的體質指數(shù)(BMI)為26.9±2.3 Kg/m~2,而多態(tài)位點rs3741930-CT+TT基因型患者的BMI為24.8±2.5 Kg/m~2,兩組之間差異具有統(tǒng)計學差異(P=0.019)。多態(tài)位點rs1056468-AA基因型患者的BMI為24.9±2.7 Kg/m~2,而多態(tài)位點rs1056468-AT+TT基因型患者的BMI為26.4±2.4 Kg/m~2,兩組之間差異具有統(tǒng)計學差異(P=0.014)。小結:KCNA5基因中SNP位點rs3741930與特發(fā)性房顫存在相關性,攜帶CC基因型的人群更易患房顫。在IAF患者中KCNA基因多態(tài)位點rs3741930和rs1056468的不同基因型之間患者的體重指數(shù)存在差異。第三部分KCNA5基因SNP位點rs3741930等位基因C和T對Kv1.5電流的影響目的:制備異源表達體系,以進一步驗證KCNA5多態(tài)性位點rs3741930與特發(fā)性房顫之間的關系。方法:使用基因工程技術將含有rs3741930多態(tài)性位點的KCNA5基因的表達載體轉染入HEK293細胞中制備異源性表達體系,并使用全細胞膜片鉗技術進行Ikur測定,以評估rs3741930位點不同等位基因對Ikur的影響。結果:全細胞膜片鉗結果顯示,rs3741930位點T等位基因組60mV處的Ikur的電流密度為45.36±7.79 pA/pF(n=13),而C等位基因組則降至為39.52±4.74 pA/pF(n=11),兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0416)。以+60mV的電流作為100%進行標準化,觀測電流-電壓曲線的形態(tài),可發(fā)現(xiàn)兩種HEK293細胞的電流-電壓曲線的形態(tài)高度重合。小結:Ikur的電壓依賴特性沒有發(fā)生轉變,C等位基因組中Ikur較T等位基因組減少的原因可能是細胞膜上KCNA5蛋白表達數(shù)目減少所致,而非蛋白鏈結構發(fā)生改變所致。結論:KCNA5基因中SNP位點rs3741930與特發(fā)性房顫存在相關,攜帶攜帶C等位基因及CC基因型的人群更易患房顫。其主要原因可能是C等位基因組較T等位基因組細胞膜上KCNA5蛋白表達數(shù)目減少,Ikur降低。在IAF患者中KCNA5基因多態(tài)位點rs3741930和rs1056468的不同基因型之間患者的體重指數(shù)存在差異。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R541.75
【圖文】：

pMD18-T-KCNA5重組質粒轉化子細胞中KCNA5基因的PCR擴增

圖 3 pcDNA3.1-T2A-EGFP 表達載體圖譜g.3 The expression vector map of pcDNA3.1-T2The gene insertion site is marked with narrow.100μ m

pcDNA3.1-T2A-EGFP 表達載體xpression vector map of pcDNA3e insertion site is marked with na

【參考文獻】

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本文編號：2790277