【摘要】：光皮樺為我國優(yōu)良速生用材樹種,其分布范圍廣,生長迅速,材質(zhì)優(yōu)良,被國家列為一級材,同時也是林木遺傳育種的的優(yōu)良材料。近年來,木材材性性狀成為林木研究的熱點之一。本論文利用生物信息學工具以及基因克隆、定量PCR等分子生物學技術(shù)挖掘光皮樺材性相關(guān)KNOX基因,分析其功能,以期為光皮樺分子輔助育種提供重要依據(jù)。主要結(jié)果如下:在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上,利用RACE技術(shù)從光皮樺中分離得到10個BlKNOX基因,序列全長范圍在4332-9208bp之間,ORF長度在408-1220bp之間,預(yù)測編碼的10個蛋白序列由136-376個氨基酸殘基組成,氨基酸序列之間一致性在12.7-64.8%之間。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)它們具有典型的KNOX結(jié)構(gòu)域,除BlKNOX6外,其他基因均具有完整的KNOX結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn),KONX蛋白主要分為兩大類:KNOXⅠ類和KNOXⅡ類。KNOXⅠ類包括:BlSTM、BlKNOX1、BlKNOX2、BlKNOX3、BlKNOX4和BlKNOX9。KNOXⅡ類包括:BlKNOX5、BlKNOX7和BlKNOX8,其中具有不完整KNOX結(jié)構(gòu)域的BlKNOX6屬于miniKNOX類。從基因結(jié)構(gòu)看,10個光皮樺BlKNOX基因結(jié)構(gòu)差異明顯,說明它們在光皮樺生長發(fā)育過程中發(fā)揮的功能可能存在差異。BlKNOX基因上游調(diào)控序列搜尋結(jié)果顯示,10個BlKNOX基因啟動子區(qū)所含順式作用元件個數(shù)和類別不同,進一步表明他們在光皮樺個體發(fā)育過程中可能扮演著不同的角色,調(diào)控不同的代謝途徑。定量PCR結(jié)果顯示10個BlKNOX基因在光皮樺的不同組織器官中特異性表達。BlKNOX1在成熟的雄花中表達量最高,其次是在莖和雌花中,而且在不同木質(zhì)化程度的莖段中,BlKNOX1表達量均有較高表達。BlKNOX2在所有莖和花中均有較高的表達量,并且隨莖段木質(zhì)化程度的升高而升高,在嫩葉中表達量最低。BlKNOX3在莖中的表達量明顯高于其它器官,且隨木質(zhì)化程度的增高而增高。BlKNOX4、BlSTM具有類似的表達模式,在莖和幼嫩雄花中具有較高的表達量,在葉中幾乎不表達。BlKNOX5、BlKNOX 7也具有類似的表達模式,分別在成熟葉和嫩葉中表達量最高。BlKNOX6和BlKNOX9都在雌花和葉中的表達量較高。BlKNOX8基本只在雌花中表達,尤其是在幼嫩雌花中表達量最高。激素處理實驗表明IAA對BlKNOX2和BlSTM表達的誘導(dǎo)效應(yīng)較明顯,并且隨著莖段木質(zhì)化程度增高誘導(dǎo)效應(yīng)越明顯。6-BA只對BlKNOX4基因的表達有明顯抑制作用。GA、ACC脅迫處理后,5個BlKNOX基因的表達情況相似,除BlSTM基因的表達量提高,其余基因的表達均受到不同程度的抑制。NAA處理對5個BlKNOX基因的誘導(dǎo)情況與GA、ACC剛好相反。不同激素處理對BlKNOX基因的誘導(dǎo)效應(yīng)不同,暗示BlKNOX基因參與的調(diào)控途徑可能并不完全相同。人工拉彎處理后5個BlKNOX基因的表達有所差別:BlKNOX1和BlSTM的表達量在TW和OW中均下降,且在TW中下降更明顯;BlKNOX2、BlKNOX7和BlKNOX4在TW中的表達量均升高,在OW中的表達量與對照相差無幾。將光皮樺BlKNOX1、BlKNOX3超表達載體分別轉(zhuǎn)化煙草和光皮樺,均獲得陽性植株。觀察煙草轉(zhuǎn)基因陽性植株發(fā)現(xiàn),與野生型相比,轉(zhuǎn)基因株系莖干更挺立,葉片邊緣產(chǎn)生皺折且葉脈更深。GUS染色也發(fā)現(xiàn),煙草陽性植株莖段能染成藍色。Maule染色法切片觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)化程度高于對照。光皮樺轉(zhuǎn)化植株目前只檢測出陽性植株,表型觀察及染色分析還需進一步探究。以上實驗結(jié)果不僅為深入解析光皮樺木材形成的分子機制奠定了基礎(chǔ),而且為后續(xù)光皮樺分子輔助育種提供了基因資源。
【學位授予單位】：浙江農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S792.15
【圖文】：

之間含有 3 個氨基酸（P-Y-P）[6,7]。KNOX 蛋白包含 4 個結(jié)構(gòu)域，依次為 KNOX1、KNOX2、ELK 和Homeobox KN[8]。KNOX1區(qū)域位于蛋白質(zhì)的 N端，下游為 KNOX2區(qū)域，KNOX1 和 KNOX2 亞域共同組成 MEINOX 區(qū)域。MEINOX 區(qū)域是由α螺旋組成的二級結(jié)構(gòu)，其中一些螺旋具有雙親和性，主要保守位點在疏水殘基。MEINOX 區(qū)域下游是不保守的 GSE 序列，可作為蛋白降解信號。緊鄰的是一個高度保守的 ELK 基序，可抑制靶基因的表達，涉及蛋白質(zhì)間的相互作用[2]。KN 位于蛋白質(zhì)的 C 端，參與 DNA 的結(jié)合和同源二聚體的形成。根據(jù)同源結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列表達模式及內(nèi)含子的位置不同，KNOX 基因可分為兩類亞家族：Ⅰ類和Ⅱ類[9,10]。在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中含 I 類和 II 類 KNOX 基因各 4 個：KN1-like in Arabidopsis thaliana1（KNAT1）、KNAT2、KNAT6 和 ShootMeristemless（STM）為 I 類； KNAT3、KNAT4、KNAT5 和 KNAT7 為 II 類。大豆（Glycine max）中 KNOX 基因有 27 個：GmKNOX1-10，GmKNOX14，GmKNOX27為 I 類；GmKNOX11-13，GmKNOX15-26，為 II 類。番茄（Solanum lycopersicum）中含 4 個 KNOX I 類基因：Tkn1、Tkn2 /Le T6、Tkn4 和 Tkn3；通過比對 II 類有3 個：Tkn1L3、T12 和 THox2。

技術(shù)路線

20圖 2.1 光皮樺 KNOX 基因氨基酸序列比對Fig 2.1 Secquence alignment of amino acid sequences of BlKNOXs genes

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本文編號：2789400