發(fā)布時(shí)間：2020-08-06 10:07

【摘要】：背景與目的:心源性猝死(Sudden Cardiac Death,SCD)嚴(yán)重危害全人類(lèi)的健康,我國(guó)每年有54.4萬(wàn)人死于SCD。90%SCD與室顫等惡性心律失常有關(guān)。人類(lèi)果蠅相關(guān)基因(Human ether-a-go-go-related gene;hERG)編碼快速激活延遲整流鉀通道(rapidly activated delayed rectifier potassium currents,Ikr)的α亞基在動(dòng)作電位3期有著重要作用,其編碼功能異常導(dǎo)致QT間期延長(zhǎng),從而引發(fā)心律失常。大量科研數(shù)據(jù)證實(shí)mi RNA與心律失常的病理生理具有一定的關(guān)聯(lián)。本研究組前期利用生物信息學(xué)比對(duì)篩選出與hERG相關(guān)的miRNA,應(yīng)用雙熒光素酶基因報(bào)告法驗(yàn)證篩選出的miRNA。研究發(fā)現(xiàn)has-miR-103a-1與hERG基因表達(dá)具有相關(guān)。本研究組前期在轉(zhuǎn)染hERG的HEK-293細(xì)胞中通過(guò)Western Blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、激光共聚焦、膜片鉗發(fā)現(xiàn)miR-103a-1可下調(diào)hERG基因表達(dá)。HEK-293由于極少表達(dá)胞外配體的受體且易于轉(zhuǎn)染,常用于外源基因的研究。但其不能模擬人心室肌細(xì)胞,且人心室肌細(xì)胞不易獲得,故在動(dòng)物心肌細(xì)胞H9C2和乳鼠原代心室肌細(xì)胞上驗(yàn)證miR-103-3p對(duì)ERG基因的調(diào)控機(jī)制。材料與方法:培養(yǎng)H9c2(2-1)細(xì)胞和SD大鼠乳鼠原代心室肌細(xì)胞。通過(guò)Lipofectamine 2000,將pcDNA3-hERG基因轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細(xì)胞,間隔24小時(shí)后再將rno-miR-103-3p agomir、rno-miR-103-3p agomir nc、rno-miR-103-3p antagomir、rnomiR-103-3p antagomirnc轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,通過(guò)采用RT-qPCR、Western Blot、細(xì)胞化學(xué)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)miR-103-3p和反義寡聚核苷酸對(duì)ERG基因表達(dá)m RNA和蛋白水平的影響。將包裝反義寡聚核苷酸AMO-103-3pNC和AMO-103-3p的慢病毒轉(zhuǎn)染乳鼠原代心室肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染96h后通過(guò)采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)反義寡聚核苷酸AMO-103-3p NC對(duì)ERG基因表達(dá)蛋白水平的影響。結(jié)果:rno-mi R-103-3p agomir nc和rno-miR-103-3p agomir轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞后:(1)RT-qPCR檢測(cè)ERG基因m RNA水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)明顯差異;(2)Western blot檢測(cè)ERG基因的蛋白表達(dá)量減少;(3)經(jīng)細(xì)胞化學(xué)免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)H9C2細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜熒光亮度下降;rno-miR-103-3p antagomirnc和rno-miR-103-3p antagomir轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞后:(1)RT-qPCR檢測(cè)ERG基因mRNA水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)明顯差異;(2)Western blot檢測(cè)ERG的蛋白水平量增加;(3)利用細(xì)胞化學(xué)免疫熒光技術(shù),H9C2細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜熒光增強(qiáng)。AMO-103-3p轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞后:ERG蛋白水平下降。結(jié)論:研究結(jié)果表明rno-miR-103-3p下調(diào)ERG基因的蛋白水平的表達(dá),AMO-103-3P通過(guò)沉默rno-miR-103-3p而使ERG蛋白水平提高。
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R541.78

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本文編號(hào)：2782222