【摘要】：背景與目的:心源性猝死(Sudden Cardiac Death,SCD)嚴重危害全人類的健康,我國每年有54.4萬人死于SCD。90%SCD與室顫等惡性心律失常有關(guān)。人類果蠅相關(guān)基因(Human ether-a-go-go-related gene;hERG)編碼快速激活延遲整流鉀通道(rapidly activated delayed rectifier potassium currents,Ikr)的α亞基在動作電位3期有著重要作用,其編碼功能異常導致QT間期延長,從而引發(fā)心律失常。大量科研數(shù)據(jù)證實mi RNA與心律失常的病理生理具有一定的關(guān)聯(lián)。本研究組前期利用生物信息學比對篩選出與hERG相關(guān)的miRNA,應(yīng)用雙熒光素酶基因報告法驗證篩選出的miRNA。研究發(fā)現(xiàn)has-miR-103a-1與hERG基因表達具有相關(guān)。本研究組前期在轉(zhuǎn)染hERG的HEK-293細胞中通過Western Blot、實時熒光定量PCR、激光共聚焦、膜片鉗發(fā)現(xiàn)miR-103a-1可下調(diào)hERG基因表達。HEK-293由于極少表達胞外配體的受體且易于轉(zhuǎn)染,常用于外源基因的研究。但其不能模擬人心室肌細胞,且人心室肌細胞不易獲得,故在動物心肌細胞H9C2和乳鼠原代心室肌細胞上驗證miR-103-3p對ERG基因的調(diào)控機制。材料與方法:培養(yǎng)H9c2(2-1)細胞和SD大鼠乳鼠原代心室肌細胞。通過Lipofectamine 2000,將pcDNA3-hERG基因轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細胞,間隔24小時后再將rno-miR-103-3p agomir、rno-miR-103-3p agomir nc、rno-miR-103-3p antagomir、rnomiR-103-3p antagomirnc轉(zhuǎn)染H9C2心肌細胞。轉(zhuǎn)染48小時后,通過采用RT-qPCR、Western Blot、細胞化學免疫熒光技術(shù)檢測miR-103-3p和反義寡聚核苷酸對ERG基因表達m RNA和蛋白水平的影響。將包裝反義寡聚核苷酸AMO-103-3pNC和AMO-103-3p的慢病毒轉(zhuǎn)染乳鼠原代心室肌細胞,轉(zhuǎn)染96h后通過采用Western Blot技術(shù)檢測反義寡聚核苷酸AMO-103-3p NC對ERG基因表達蛋白水平的影響。結(jié)果:rno-mi R-103-3p agomir nc和rno-miR-103-3p agomir轉(zhuǎn)染H9C2細胞后:(1)RT-qPCR檢測ERG基因m RNA水平,實驗結(jié)果顯示無明顯差異;(2)Western blot檢測ERG基因的蛋白表達量減少;(3)經(jīng)細胞化學免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)H9C2細胞胞質(zhì)和胞膜熒光亮度下降;rno-miR-103-3p antagomirnc和rno-miR-103-3p antagomir轉(zhuǎn)染H9C2細胞后:(1)RT-qPCR檢測ERG基因mRNA水平,實驗結(jié)果顯示無明顯差異;(2)Western blot檢測ERG的蛋白水平量增加;(3)利用細胞化學免疫熒光技術(shù),H9C2細胞胞質(zhì)和胞膜熒光增強。AMO-103-3p轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細胞后:ERG蛋白水平下降。結(jié)論:研究結(jié)果表明rno-miR-103-3p下調(diào)ERG基因的蛋白水平的表達,AMO-103-3P通過沉默rno-miR-103-3p而使ERG蛋白水平提高。
【學位授予單位】：寧波大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R541.78

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