【摘要】：本實(shí)驗(yàn)室通過篩選一系列化合物發(fā)現(xiàn),源于植物黃花蒿的活性物質(zhì)東莨菪內(nèi)酯對(duì)朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)具有良好的觸殺、趨避以及產(chǎn)卵抑制等活性,具有開發(fā)成綠色殺螨劑潛力,但是其殺螨的作用機(jī)制或者分子靶標(biāo)仍不清楚。因此明確東莨菪內(nèi)酯對(duì)朱砂葉螨殺螨作用的機(jī)制和分子靶標(biāo),為以東莨菪內(nèi)酯為模板進(jìn)行分子設(shè)計(jì),開發(fā)高效、安全、具有新的作用靶標(biāo)的殺螨劑提供理論依據(jù),為創(chuàng)制擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型綠色殺螨劑奠定基礎(chǔ)。本論文以東莨菪內(nèi)酯對(duì)朱砂葉螨致毒作用的鈣離子通道相關(guān)基因?yàn)檠芯繉?duì)象,進(jìn)行了東莨菪內(nèi)酯對(duì)朱砂葉螨殺螨機(jī)制相關(guān)基因及分子靶標(biāo)鑒定的系統(tǒng)研究,取得了以下研究成果:1.獲得并驗(yàn)證了數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果,明確了東莨菪內(nèi)酯處理下朱砂葉螨響應(yīng)基因參與的主要生物學(xué)過程處理組和溶劑對(duì)照組測(cè)序分別得到52,496,305條和52,286,859條Reads。24 h和48 h的差異表達(dá)基因分別為15481條和15411條。滿足偏離概率值≥0.8并且log2Ratio≥1的顯著差異基因分別有70條和102條。此外,qPCR證實(shí)了mRNA測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性,也說明參與驗(yàn)證的15條基因確實(shí)對(duì)東莨菪內(nèi)酯發(fā)生了響應(yīng)。Gene Ontology(GO)功能顯著性富集分析明確了顯著差異基因參與的主要生物學(xué)過程主要包括細(xì)胞生理過程、代謝過程、單生物過程、細(xì)胞凋亡、連接和催化活性、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)傳導(dǎo)等。KEGG通路富集分析羅列了24 h和48h富集程度排名前20的生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,其中磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、鈣信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路是最具代表性的生化途徑。這些GO條目和KEGG條目里所包含的基因很可能與東莨菪內(nèi)酯殺螨機(jī)制密切相關(guān)。2.獲得了與螨體代謝、鈣信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)的顯著差異基因,測(cè)定了東莨菪內(nèi)酯處理下3條鈣離子通道相關(guān)基因表達(dá)量變化通過RPKM(每百萬reads中來自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù))和Noiseq算法,篩選出兩處理時(shí)間段的顯著差異基因總條數(shù)為172條,共有基因?yàn)?8條。本研究獲得了獲得了3條與鈣離子通道密切相關(guān)的基因,如鳥苷酸激酶(GUK)、細(xì)胞凋亡蛋白(BAG)和G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)肽受體(GPCR),其是重要的信號(hào)傳導(dǎo)類基因也是差異表達(dá)比較明顯的基因;qPCR進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果表明,東莨菪內(nèi)酯處理上調(diào)TcGPCR的表達(dá),下調(diào)TcBAG和TcGUK表達(dá),其可作為以后東莨菪內(nèi)酯殺螨作用機(jī)理研究的關(guān)鍵基因。3.克隆并分析了朱砂葉螨鳥苷酸激酶、細(xì)胞凋亡蛋白和G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)肽受體基因基因的cDNA序列及其表達(dá)模式通過克隆獲得了鳥苷酸激酶、細(xì)胞凋亡蛋白和G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)肽受體基因cDNA序列,分別命名為TcGUK,TcBAG和TcGPCR,登錄號(hào)分別是:KY660540、KY660539和KY660538。此外,通過序列比對(duì)、進(jìn)化樹分析、蛋白跨膜結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其同其它物種同源性基因具有較高的相似度,其與鈣離子通道密切相關(guān),是鈣離子通道相關(guān)基因。對(duì)這些鈣離子通道相關(guān)基因(TcGPCR,TcBAG和TcGUK)的不同螨態(tài)表達(dá)模式分析結(jié)果顯示,其在幼螨和若螨階段的表達(dá)水平均顯著高于朱砂葉螨其他發(fā)育階段。4.東莨菪內(nèi)酯對(duì)朱砂葉螨致毒作用的分子靶標(biāo)的鑒定通過RNAi技術(shù)鑒定東莨菪內(nèi)酯的作用靶標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3條鈣通道相關(guān)基因都與東莨菪內(nèi)酯的殺螨活性相關(guān);也就是,下調(diào)TcBAG和TcGUK后增強(qiáng)了朱砂葉螨對(duì)東莨菪內(nèi)酯的敏感性,下調(diào)TcGPCR后降低了朱砂葉螨對(duì)東莨菪內(nèi)酯的敏感性。另外,我們成功的把TcGPCR在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)進(jìn)行了功能表達(dá),同時(shí)進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)鈣離子流動(dòng)的測(cè)定。藥理數(shù)據(jù)結(jié)果表明,東莨菪內(nèi)酯以濃度依賴性的方式強(qiáng)烈激活TcGPCR。同時(shí),香豆素衍生物對(duì)TcGPCR有激動(dòng)活性,且其活性位點(diǎn)為C-6,C-7,這表明香豆素類化合物可能具有相似的分子靶點(diǎn)。目前的研究結(jié)果可以明確GPCR敏感型鈣離子釋放通道可能是天然產(chǎn)物殺螨劑東莨菪內(nèi)酯的首要作用靶標(biāo);同時(shí),也不能排除其他鈣離子通道相關(guān)基因:TcBAG和TcGUK作為東莨菪內(nèi)酯殺螨劑作用靶標(biāo)的可能性。此外,香豆素類殺螨活性化合物可能具有相同的分子靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S481
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述 數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序技術(shù)數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）是聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的建庫(kù)手段，在葉究某個(gè)特定的生物過程的差異表達(dá)基因，而且能夠快速篩選和鑒定出一系列候東莨菪內(nèi)酯殺螨機(jī)制研究尤為必要。用于檢測(cè)基因表達(dá)的數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序示，首先利用 RNA-Seq 測(cè)序，然后對(duì)基因表達(dá)差異進(jìn)行解析，緊接著對(duì)差異ne Ontology 和 KEGG Pathway 富集分析，從而找到研究吻合的代謝通路相關(guān)終進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，例如：基因克隆、基因敲除、RNAi、RT-PCR 等實(shí)驗(yàn)譜測(cè)序技術(shù)能夠有效地闡明葉螨應(yīng)對(duì)藥物刺激后在基因水平上的響應(yīng)和該基因的生理代謝過程以及信號(hào)傳導(dǎo)通路等。目前，數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序技術(shù)在葉螨劑抗性分子機(jī)制以及寄主互作機(jī)制的研究。因此，在朱砂葉螨響應(yīng)東莨菪內(nèi)酯制研究中，該測(cè)序方法能有效的挖掘響應(yīng)的候選靶標(biāo)基因，為闡明東莨菪內(nèi)酯定基礎(chǔ)。

論文選題依據(jù)與研究?jī)?nèi)容.1 選題依據(jù)由于朱砂葉螨自身特性以及化學(xué)農(nóng)藥的抗性、環(huán)境污染、濫用等問題導(dǎo)致化學(xué)防治害螨經(jīng)很難滿足環(huán)境和治理等要求,因此，朱砂葉螨對(duì)我國(guó)的農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)帶來重大危害。所以植源殺螨劑的研發(fā)正當(dāng)其時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室通過篩選發(fā)現(xiàn)東莨菪內(nèi)酯對(duì)朱砂葉螨表現(xiàn)出較好的防效果，并且該化合物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，利于儲(chǔ)存，又能通過化學(xué)等方法合成，對(duì)非靶標(biāo)類物安全，害螨不易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，具有開發(fā)為綠色殺螨劑的潛力。除此之外，從研究害控制劑的角度出發(fā)，研究天然產(chǎn)物殺螨劑的最終目的，一是發(fā)現(xiàn)具有高度殺螨活性的先導(dǎo)合物；二是發(fā)現(xiàn)殺螨劑新的作用靶標(biāo)，進(jìn)而開發(fā)新型、綠色殺螨劑。然而，與大多數(shù)常規(guī)學(xué)殺螨藥劑相比，東莨菪內(nèi)酯的殺螨活性、藥劑利用率仍然較低，要開發(fā)出與環(huán)境相容性、備高效殺螨活性的新型植物源殺螨劑，還需根據(jù)東莨菪內(nèi)酯的靶標(biāo)位點(diǎn)，利用化學(xué)合成等段對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造，因此闡明東莨菪內(nèi)酯的作用機(jī)制和靶標(biāo)位點(diǎn)勢(shì)在必行。圖 1-3 dsRNA 作用機(jī)制Fig. 1-3 Mechanism of dsRNA

經(jīng)過濾后得到總 clean reads，利用基因組比分析和差異基因篩選等各項(xiàng)分析，以此挖PCR 檢測(cè)對(duì)測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確度的驗(yàn)證，所以必須保證試著差異表達(dá)的基因，利用 Primer 3.0 (http://表 2-1 所示。采用 Sun[92]等人經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)表 2-1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物le 2-1 Primers used in Real-time fluorescence q圖 2-1 RNA-Seq 實(shí)驗(yàn)流程圖2-1 Experiment pipeline of RNA-Seq in T. cinn

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2773231