【摘要】：水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一,養(yǎng)活全球近60%的人口。近年來隨著環(huán)境問題加劇、耕地面積減少,提高谷物產(chǎn)量已成為水稻生產(chǎn)的一個重大挑戰(zhàn)。籽粒形狀不僅決定粒重、影響水稻產(chǎn)量,而且影響稻米的品質和市場價值。隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展以及水稻基因組測序的完成,越來越多的粒型調控基因在水稻中被克隆。然而,由于研究者對關鍵調控基因的分子機理知之甚少,加之實際育種過程中存在不良性狀連鎖等問題,已克隆的粒型調控基因的利用率并不高。因此,繼續(xù)克隆調控粒型的關鍵基因,解析粒型調控的分子機理,對于培育高產(chǎn)、優(yōu)質水稻新品種具有重要意義。本研究通過同源克隆的方式克隆了水稻粒型基因GW5L,它是粒寬主效QTL GW5的同源基因,編碼一個膜定位的IQ蛋白。GW5L可以與GSK2蛋白激酶互作,并且通過抑制其磷酸化正向調控BR信號,從而影響籽粒形狀;另外,GW5L還可以參與鈣調素蛋白OsCaM1-1介導的抗鹽反應。本研究對GW5L基因的結構與功能等做了研究與分析,主要結論如下。1.采用同源克隆方式,以GW5編碼的蛋白序列為參照在水稻基因組中克隆了GW5L基因。由于所編碼蛋白結構高度一致,推測GW5L和GW5有相似的生物學功能。轉基因實驗發(fā)現(xiàn),GW5L過表達植株表現(xiàn)出典型的BR過量表型,包括植株變矮、葉夾角變大、籽粒變細長等;GW5L敲除家系出現(xiàn)籽粒變寬變短的表型。因此,GW5L是一個粒寬的負調控因子。2.BR是重要的植物激素,在水稻中發(fā)揮著重要功能。葉夾角BR敏感性實驗證明,GW5L過表達家系的表型是由于BR信號的增強引起的。GW5L過表達轉基因植株的qRT-PCR分析顯示,D2、D11、Dwarf4等具有反饋調節(jié)效應的BR合成基因在GW5L過表達轉基因植株中的表達有所下降。因此,推斷GW5L通過BR信號途徑影響粒型形成。3.為驗證GW5L是否與GW5的互作蛋白GSK2互作,進行了酵母雙雜、雙分子熒光互補(BiFC)以及體外Pull-down實驗,結果證實GW5L與GSK2確實存在互作關系。體外磷酸化實驗進一步證明GW5L可以抑制GSK2自身磷酸化及磷酸化下游BZR1轉錄因子,并確定了GW5L在BR信號網(wǎng)絡中的位置。GW5L通過抑制下游蛋白激酶GSK2的功能來調控BR信號傳遞,最終影響籽粒大小。4.酵母雙雜交和BiFC實驗均證實GW5L與鈣調素蛋白OsCaM1-1互作,而OsCam1-1參與ABA介導的鹽脅迫抗性,據(jù)此推測GW5L與水稻抗鹽性相關。鹽脅迫處理實驗顯示,GW5L過表達家系對鹽脅迫更加敏感。qRT-PCR結果顯示GW5L過表達家系鹽敏感度的提高是由于OsCam1-1的表達量下降引起。GW5L與OsCam1-1介導的鹽脅迫抗性有關,為揭示IQ蛋白與鹽脅迫的關系提供了線索。5.GW5L與GW5具有相似的蛋白結構和生化功能,但基因表達模式存在差異。與GW5在穗部高表達相比,GW5L在被檢測的各器官中表達水平均較高。這暗示著二者很可能在不同的組織中調控不同代謝途徑。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S511
【圖文】：

中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 引言3圖1.1 調控水稻籽粒大小關鍵基因調控模式圖（Li et al., 2018）。Figure 1.1 A schematic representation illustrating major regulatory genes that control seed size.水稻的籽粒大小是由水稻小穗穎殼中細胞的分裂與伸長調控。調控水稻籽粒大小的代謝途徑有：泛素蛋白酶體途徑（UPS）、G 蛋白途徑、MAPK 途徑、植物激素途徑、轉錄因子途徑等。圖中正向調控因子與反向調控因子分別用紅色與綠色表示。調控細胞增殖的元件位于示意圖左側，用綠色分開；調控細胞伸長的位于示意圖右側，用黃色虛線分開；那些既調控細胞增殖又調控細胞伸長的元件位于綠色與黃色虛線之間。星號表示該元件的調控模式?jīng)]有得到準確的驗證。標尺=1 mm。The grain size of rice is regulated by cell proliferation and cell expansion in the glume of rice spikelets. The metabolic pathways regulatingrice grain size include: ubiquitin-proteasome (UPS) pathway, G-protein signaling, MAPK signaling, phytohormones and transcriptionalregulatoryfactors. The positive and negative regulators in the figure are shown in red and green respectively. The originals that regulate cellproliferation are located on the left side of the diagram, separated by green dotted lines; the cells that regulate cell elongation are on the right sideof the diagram, separated by yellow dotted lines; those that regulate cell proliferation and regulate cell elongation are located between green andyellow dashed lines. The asterisk indicates that the original control mode has not been accurately verified

生物體生長發(fā)育過程中，經(jīng)常需要自行降解一些無用蛋白或需要調節(jié)的蛋白，以實現(xiàn)對特的生命活動的精確調控，從而有效調節(jié)蛋白的生命周轉，循環(huán)利用生命原料。泛素化是細胞內種特異性的修飾，可以作為一種標簽將被選擇降解的蛋白標記，該過程涉及泛素、啟動酶系統(tǒng)（E1、E2 和 E3）以及蛋白酶體系統(tǒng)(Pickart and Eddins, 2004)。最近的研究證明泛素降解途徑在稻粒型調控中也發(fā)揮著重要作用，目前已克隆的泛素依賴性蛋白降解途徑水稻粒型調控基因包GW2、TUD1、HGW 等。GW2 (GRAINWIDTH 2)是一個控制粒寬及粒重的主效 QTL，位于第 2 號染色體。Song 等（20年）利用由大粒粳稻品種 WY3 和小粒秈稻品種豐矮占 1 號構建的遺傳群體圖位克隆到該基因GW2 編碼一個 E3 泛素連接酶，通過參與細胞分裂相關蛋白的泛素化降解過程，從而影響水稻殼細胞分裂，調控水稻籽粒大�。▓D 1.2）。GW2 功能缺失導致籽粒變寬，但不影響胚乳細胞數(shù)目只是導致胚乳細胞變大，這說明 GW2 通過不同的機制控制穎殼及胚乳的發(fā)育。gw2 在增加穎大小的同時提高灌漿速率和干物質積累，因此對稻米品質的影響不大，不會導致高堊白等負面狀，在優(yōu)良稻米品種選育中具有較高的利用價值(Song et al., 2007)。

該基因表達產(chǎn)物定位在細胞核中，并且其表達受到生長素的調節(jié)。SMOS1 可細胞擴增相關基因 OsPHI-1 的啟動子并調控其表達(Aya et al.,2014)。最近有報道證明，SM與 BR 信號途徑傳導蛋白 DLT 互作，并且二者同時存在時可促進下游基因 OsPHI-1 的表達，SMOS1 與 DLT 形成了一個關鍵復合體，共同響應水稻中生長素與 BR 信號，為解釋水同激素的信號交聯(lián)提供了依據(jù)(Hirano et al., 2017)。GL4 是非洲稻中一個調控粒型的主效基因，可通過調控外稃與Qg稃中細胞大小來影響籽小。GL4 不僅影響籽粒的大小，同時又影響落粒性，這一點與其在亞洲稻中的同源基因 同。GL4 與 SH4 編碼區(qū)中一個 SNP 導致翻譯的提前終止，最終導致了小粒與落粒性增強。GL4 的克隆為研究非洲稻的馴化奠定了基礎，同時為水稻優(yōu)質高產(chǎn)育種提供了新的材料(W, 2017)。OsBUL1 (BRASSINOSTEROID UPREGULATED 1-LIKE1) 編 碼 一 個 非 典 型 的 Helix-loop-helix)類轉錄因子，其表達量受 BL 的誘導，功能缺失后會出現(xiàn)葉夾角減小，籽粒表型。OsBUL1 可以與未知蛋白 LO9-177 以及另一個 bHLH (basic helix-loop-helix)蛋白 Os成轉錄復合體，共同調控細胞的伸長以及籽粒的大�。▓D 1.4）。同時，OsBC1 的表達也 的誘導且功能缺失后出現(xiàn)與 OsBUL1 突變類似的表型。OsBUL1 與 OsBC1 的克隆對于H-bHLH 復合體代謝及其調控細胞伸長、籽粒大小的分子機理打下了基礎(Jang et al., 2017

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