【摘要】：黃瓜(Cucumis sativus L.)屬葫蘆科甜瓜屬蔬菜,是全球消費量最大的十類蔬菜之一,深得世界各國人民喜愛。也是一種對銅(Cu)脅迫非常敏感的蔬菜作物。近年來,隨著高Cu畜肥、殺菌劑、殺蟲劑等的不合理施用,使土壤Cu污染日益嚴重,進而對蔬菜的產量和品質造成較大影響,或間接通過食物鏈途徑來危害動物和人類。因此有效提高黃瓜耐Cu脅迫能力,培育耐Cu黃瓜品種對于創(chuàng)造綠色農業(yè)、現(xiàn)代農業(yè)具有重要意義。為了探究黃瓜耐Cu分子機制,挖掘耐Cu相關基因能夠為耐Cu黃瓜品種提供理論參考。為了加深人們對黃瓜耐Cu機制的理解,本研究以黃瓜品種‘649’為試驗材料。根據(jù)目標基因CsLecRK響應Cu的表達模式及保守性為線索,結合轉基因等技術,克隆黃瓜耐Cu相關基因CsLecRK,同時對CsLecRK基因功能進行分析,初步闡述黃瓜耐Cu相關基因CsLecRK在Cu脅迫過程中的生理與分子作用機制。主要研究結果如下:(1)前期基于擬南芥在Cu脅迫下基因的表達模式分析,進而將其基因序列與黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫進行同源比對,又結合采用生物信息學分析方法對黃瓜中潛在的耐Cu相關基因進一步篩選,并保證該基因在相關重金屬的功能尚未見報道,初步將擬南芥LecRK基因設定為研究的對象。通過DNAMAN軟件對該基因和CsLecRK的氨基酸同源性進行比較,得出二者同源性為46%。進一步通過qRT-PCR分析表明,CsLecRK在Cu脅迫條件下表達顯著下調,降低了4.39倍。本研究結果表明CsLecRK在黃瓜中受Cu脅迫誘導特異表達,該基因可能與黃瓜耐Cu能力相關。也暗示CsLecRK為黃瓜耐Cu脅迫的新基因。(2)采用PCR技術克隆黃瓜耐Cu脅迫相關基因CsLecRK,其CDS全長為2121 bp,編碼一個含有706個氨基酸的蛋白質,屬于LecRK超家族之一,理論分子量為78.36 kDa,等電點為7.76。NCBI Blastp分析與進化樹分析均表明,CsLecRK編碼蛋白與甜瓜的LecRK序列同源性最高(95%),進化距離最近。(3)構建植物過量表達載體1250-3301::CsLecRK,將CsLecRK基因轉入哥倫比亞野生型擬南芥。結果表明,50?M Cu處理后野生型根長明顯受到抑制而變短,為0.8443±0.0628 cm;在正常條件下,轉基因植株與野生型根長沒有顯著差異,在50?M Cu脅迫條件下野生型和轉基因植株根長都明顯變短,但轉基因的根長仍然比野生型長。此外,在50?M Cu脅迫條件下,野生型和3個轉基因植株地上部及根部的鮮重和干重分別減少,較正常條件下,地上部鮮重分別減少了59.16%、33.92%、29.36%、43.65%,根部鮮重分別減少了68.46%、51.39%、51.42%、49.49%。地上部干重分別減少了66.19%、40.72%、32.06%、24.47%。(4)將轉基因擬南芥株系和野生型擬南芥進行正常條件和50?M Cu處理,過氧化氫(H_2O_2)和丙二醛(MDA)測定結果表明:轉基因植株地上部H_2O_2含量在正常條件下顯著高于野生型植株H_2O_2含量,然而在50?M Cu脅迫下,二者H_2O_2含量沒有顯著差異,但在根部組織中,50?M Cu脅迫下,轉基因植株的H_2O_2含量顯著低于野生型,此外,在正常條件下,地上部轉基因植株與野生型的MDA含量無明顯差異,但50?M Cu脅迫下,無論是地上部還是根組織中轉基因植株的MDA含量顯著低于野生型。而Cu脅迫后轉基因株系的地上部或根中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性水平明顯高于野生型。又通過萌發(fā)率結果發(fā)現(xiàn):在0.3μM ABA的MS培養(yǎng)基上,3個轉基因擬南芥種子萌發(fā)率顯著高于野生型,這些結果表明在Cu脅迫以后,CsLecRK基因過表達可能參與ABA信號的轉導,降低植株內H_2O_2和MDA的含量的累積,進一步提高植物體內抗氧化酶活性水平,從而在Cu脅迫條件下能夠提高植株的Cu耐受性來維持其正常生長發(fā)育。此外,Cu處理后轉基因株系中Cu調節(jié)基因AtSPL7,ABA響應基因AtRAB18和AtABI5表達量明顯高于野生型。這說明轉基因植物表現(xiàn)出的Cu耐受性可能由于這些基因編碼的蛋白質之間的相互協(xié)作。上述結果表明CsLecRK的過量表達可以提高擬南芥的Cu耐受性。
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S642.2
【圖文】：

lus；1：CsLecRK 基因圖 3-3 CsLecRK 全長擴增Fig.3-3 Cloning of CDS sequences of CsLecRK 基因氨基酸序列分析及進化

圖 3-4 CsLecRK 序列與氨基酸序列信息Fig.3-4 Information of CsLecRK and amino acid sequence in Cucumber用 NCBI對該基因的氨基酸序列保守結構域分析發(fā)現(xiàn)（圖 3-5），其蛋白屬于 lectinfamily 和 PKc-like superfamily 超基因家族之一。

CsLecRK蛋白保守結構域Fig.3-5ConserveddomaininCsLecRK

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本文編號：2770115