【摘要】：體細(xì)胞胚胎發(fā)生是植物體細(xì)胞不經(jīng)過(guò)雙受精在體外培養(yǎng)再生成為胚并發(fā)育成為一棵完整植株的過(guò)程。隨著棉花組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生成為棉花遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的基礎(chǔ)。生長(zhǎng)素是體細(xì)胞胚胎發(fā)生重要的調(diào)節(jié)因子之一。在本實(shí)驗(yàn)室前期的體胚發(fā)生表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)一個(gè)差異表達(dá)的NF-YB類轉(zhuǎn)錄因子,GhL1L1,該基因在棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中差異表達(dá)。本研究對(duì)GhL1L1在棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的功能進(jìn)行研究,結(jié)果如下:1、陸地棉GhL1L1的克隆及表達(dá)分析根據(jù)棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程的表達(dá)譜分析結(jié)果,我們克隆到陸地棉GhL1L1基因,編碼NF-YB亞家族的蛋白;陸地棉TM-1全基因組存在41個(gè)NF-YB亞家族的基因,根據(jù)同源性比對(duì)結(jié)果,有6個(gè)屬于LEC1類,其余為非LEC1類;6個(gè)LEC1類的NF-YB基因分別分布在A和D亞基因組上,編碼3個(gè)同源的蛋白。組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)LEC1類的NF-YB基因主要在開花后20天的種子、胚性愈傷組織、體細(xì)胞胚和合子胚等胚性細(xì)胞組織中表達(dá),其中,GhL1L1(Gh_D05G1686)在胚性細(xì)胞組織中的表達(dá)量最高。2、陸地棉GhL1L1調(diào)控棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的細(xì)胞命運(yùn)為了驗(yàn)證GhL1L1在棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的功能,我們構(gòu)建了超表達(dá)和干涉表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化棉花。結(jié)果發(fā)現(xiàn)超表達(dá)GhL1L1抑制非胚性愈傷組織的起始和增殖,外植體的極性生長(zhǎng)狀態(tài)不明顯,超表達(dá)GhL1L1促進(jìn)胚性愈傷組織的產(chǎn)生及體細(xì)胞胚的發(fā)生,伴隨著胚性細(xì)胞形成的標(biāo)志基因Gh FUS3和Gh ABI3的表達(dá)量顯著升高。GhL1L1干涉株系愈傷組織增殖率與對(duì)照相比差異不大,外植體愈傷組織的生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯的極性生長(zhǎng),但GhL1L1干涉株系胚性愈傷產(chǎn)生的時(shí)間明顯推遲。3、陸地棉GhL1L1影響棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中生長(zhǎng)素的積累和分布為了研究GhL1L1與生長(zhǎng)素之間的關(guān)系,我們檢測(cè)了GhL1L1轉(zhuǎn)基因和對(duì)照株系誘導(dǎo)培養(yǎng)25 d、40 d的外植體和胚性愈傷組織中的生長(zhǎng)素含量,結(jié)果顯示超表達(dá)GhL1L1誘導(dǎo)25 d和40 d的外植體中的生長(zhǎng)素含量顯著高于對(duì)照和干涉株系;此外,在GhL1L1超表達(dá)株系胚性愈傷組織生長(zhǎng)素的含量顯著高于陰性對(duì)照,而GhL1L1干涉株系胚性愈傷組織生長(zhǎng)素的含量顯著低于陰性對(duì)照。為了研究GhL1L1與生長(zhǎng)素分布的關(guān)系,GhL1L1轉(zhuǎn)基因和陰性對(duì)照株系與DR5::GUS株系進(jìn)行雜交,在超表達(dá)GhL1L1的莖頂端分生組織中GUS染色較深,有較多的生長(zhǎng)素積累;通過(guò)GUS染色切片和IAA免疫熒光切片觀察發(fā)現(xiàn),在超表達(dá)和抑制表達(dá)GhL1L1的魚雷胚中生長(zhǎng)素的分布均會(huì)受到不同程度的影響。4、陸地棉GhL1L1與GhPP2AA2結(jié)合調(diào)控Gh PIN1蛋白的表達(dá)酵母單雜交和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,GhL1L1可以與GhPP2AA2啟動(dòng)子區(qū)域的G-box元件結(jié)合,調(diào)控其表達(dá)。此外,通過(guò)體外pull-down實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)Bi FC及蛋白共定位實(shí)驗(yàn)證明,GhPP2AA2可以與Gh PIN1蛋白相互作用,GhPP2AA2蛋白與擬南芥At PP2AA2蛋白較為同源,At PP2AA2可以去磷酸化PIN1蛋白,影響PIN1蛋白的磷酸化狀態(tài)和定位。因此,GhL1L1可能通過(guò)GhPP2AA2調(diào)控Gh PIN1蛋白的活性而影響生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸和分布。5、抑制生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸可以促進(jìn)棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生為了確定Gh PIN1蛋白的定位改變是否會(huì)影響棉花的體細(xì)胞胚胎發(fā)生,在GhL1L1轉(zhuǎn)基因和陰性對(duì)照外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素運(yùn)輸抑制劑TIBA。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TIBA可以影響生長(zhǎng)素的分布,抑制愈傷組織的增殖,誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d GhL1L1轉(zhuǎn)基因和陰性對(duì)照外植體的愈傷增殖沒(méi)有明顯的差異;同時(shí),TIBA處理可以促進(jìn)胚性愈傷組織細(xì)胞的提前分化,特別是在GhL1L1的干涉株系至少提前10天出現(xiàn)胚性愈傷組織,GhL1L1轉(zhuǎn)基因和陰性對(duì)照株系外植體愈傷組織的分化率都有一定的提高。6、陸地棉GhL1L1調(diào)控脂肪酸的合成在棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中超表達(dá)GhL1L1可以增加棉花亞油酸的含量。為了進(jìn)一步研究GhL1L1的調(diào)控機(jī)理,我們通過(guò)酵母雙雜交和免疫沉淀質(zhì)譜分析(IP-MS)的方法鑒定GhL1L1相互結(jié)合的蛋白,通過(guò)Pull-down,Bi FC和Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GhL1L1與Gh NF-YC2和Gh NF-YC9相互作用,GhL1L1與Gh NF-YC2可以與Gh SSI2的啟動(dòng)子結(jié)合,推測(cè)GhL1L1通過(guò)調(diào)控Gh SSI2影響脂肪酸的合成。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S562
【圖文】：

植物的胚胎發(fā)生是植物生命周期中的一個(gè)重要過(guò)程。在高等植物中，植物的胚胎發(fā)生受到遺傳和環(huán)境的共同影響，合子胚的發(fā)育過(guò)程經(jīng)歷了受精卵的分裂、極性的建立、形態(tài)建成和器官發(fā)生等一系列發(fā)育過(guò)程。模式植物擬南芥的胚胎發(fā)生過(guò)程研究的較為透徹，如圖 1.1 所示，受精卵在自身的擴(kuò)增后，經(jīng)過(guò)一次極性的分裂形成頂細(xì)胞和基細(xì)胞，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育，頂細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)比較稠密，有大量有活性的蛋白質(zhì)合成，發(fā)育成為原胚，而基細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)較少，隨后發(fā)育高度液泡化，發(fā)育成胚柄（Mansfield et al., 1991）。頂細(xì)胞在經(jīng)過(guò)兩次垂直分裂和一次水平分裂后變成 8細(xì)胞胚，形成不同的細(xì)胞，行使不同的功能。隨后進(jìn)行快速分裂進(jìn)入 16 細(xì)胞胚和早期心形胚時(shí)期，在胚發(fā)育的后期形成子葉胚。最上端的胚柄細(xì)胞發(fā)育成為胚根原細(xì)胞，根原細(xì)胞經(jīng)過(guò)一次不對(duì)稱分裂后變成上下兩個(gè)細(xì)胞，上面的細(xì)胞經(jīng)垂周分裂成兩個(gè)細(xì)胞，形成擬南芥的靜止中心，下面的細(xì)胞繼續(xù)分裂形成小柱細(xì)胞，共同參與根尖分生組織的形態(tài)建成（Arnaud Capron et al., 2009; Scheres et al., 1994）。

圖 1.2 PIN 蛋白依賴于磷酸化和胞吞作用的極性運(yùn)輸改變示意圖；P，磷酸化蛋白；PID，PINOID；RE，再循環(huán)內(nèi)體；TGN，高爾基體網(wǎng)絡(luò)（atic representation of transcytosis and phosphorylation-dependent polarity EE, early endosomes; P, phosphorylated protein; PID, PINOID; REN, trans-golgi network (Grunewald et al., 2010).的胚胎發(fā)育，植物再生也是植物進(jìn)行自我繁殖的一種有效手器官?gòu)念^發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生。器官?gòu)念^發(fā)生是植物實(shí)現(xiàn)擬南芥葉片離體培養(yǎng)可以自發(fā)再生出不定根，葉片離體后積素，促進(jìn)葉片中細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變從而實(shí)現(xiàn)根的從頭再生過(guò)程物器官具有較強(qiáng)的再生能力，在綠藻，苔蘚中存在很明顯的根、莖、葉各個(gè)組織在一定的環(huán)境下培養(yǎng)可以進(jìn)行器官再生

而在不同的植物中，不同組織部位的外植體在一定的條件下也可進(jìn)行體細(xì)胞再生（Ikeuchi et al., 2016），如圖1.3 所示。同時(shí)，35S 啟動(dòng)子組成型超量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 Baby Boom (BBM)、Wuschel2

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本文編號(hào)：2769976