發(fā)布時(shí)間：2020-07-16 11:03

【摘要】：鴨疫里默氏桿菌(Riemrella anatipestifer,RA)是一種主要感染鴨類、鵝類,造成感染動(dòng)物發(fā)病,以心包炎、肝周炎為主要特征的一種接觸性病原菌。感染鴨發(fā)病、死亡率可分別高達(dá)90%和75%,已經(jīng)嚴(yán)重影響了養(yǎng)鴨業(yè)。生物素(Vitamin H或Co-R),作為生物體內(nèi)關(guān)鍵酶的發(fā)揮活性所必須的輔因子,有著不可或缺的作用。主要包括:丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC)和酰基輔酶A羧化酶(Acyl-CoA carboxylase,ACC)等,主要通過(guò)羧化、脫羧和轉(zhuǎn)羧基的作用,參與到脂肪酸合成、糖異生以及氨基酸代謝等途徑。生物體攝取生物素有兩種途徑,一種是通過(guò)自身合成,另一種是從外界環(huán)境中攝取。大多數(shù)微生物、植物以及真菌都通過(guò)第一種方式獲得,而哺乳動(dòng)物及人類則由于缺少合成生物素相關(guān)酶系,必須通過(guò)第二種途徑獲得。因此生物素的合成途徑有可能成為研發(fā)新型抗菌素富有潛力的藥物靶標(biāo)。本研究從隨機(jī)轉(zhuǎn)座子突變庫(kù)中篩選到一株生物素合成相關(guān)基因突變株,分析了該突變株的相關(guān)生物學(xué)特性,并對(duì)突變株的免疫效果作了評(píng)估。本研究包括以下2部分內(nèi)容:一、前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)bioF同源基因AS87_RS09170與RA毒力相關(guān)。在本研究中,通過(guò)序列分析表明,AS87_RS09170基因在RA中高度保守,該基因的編碼產(chǎn)物8-氨基-7-氧代壬酸合成酶(AONS)具有保守的吡哆醛5'-磷酸結(jié)合中心。Western blot分析表明突變株Yb2ΔbioF的兩種生物素依賴性酶的同工型比野生株Yb2的表達(dá)量顯著降低,表明突變株Yb2ΔbioF生物素生物合成減少。生長(zhǎng)曲線的測(cè)定表明,Yb2ΔbioF是一種生物素缺陷型菌株,其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)速率顯著降低,在補(bǔ)充生物素的條件下,可以回復(fù)到野生株的水平。電鏡觀察顯示突變株Yb2ΔbioF細(xì)胞外形不規(guī)則,含有多個(gè)牙生的贅生物,外膜凹凸不平,局部不規(guī)則增厚。與野生株相比,Yb2ΔbioF對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞的黏附入侵能力和生物被膜形成能力顯著增強(qiáng)。此外,突變株Yb2ΔbioF感染雛鴨的血液載菌量顯著低于相同劑量野生株感染雛鴨的載菌量,表明AS87_RS09170在RA感染雛鴨模型中建立全身感染至關(guān)重要。本研究首次證實(shí)RA生物素的生物合成與細(xì)菌生物學(xué)特性和致病性相關(guān)。二、本研究對(duì)突變株Yb2ΔbioF作為弱毒苗的免疫效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。將突變株Yb2ΔbioF在TSB和TSA中連續(xù)交替?zhèn)鞔?0次,每隔10代對(duì)其菌株形態(tài)、生化反應(yīng)特性、分子生物學(xué)特性以及對(duì)易感日齡櫻桃谷鴨的致病性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示Yb2ΔbioF在體外連續(xù)傳代30次后各種特性均不發(fā)生變化,其毒力未見返強(qiáng)。取第30代菌液(Yb2ΔbioF-F30)感染18日齡櫻桃谷鴨,感染后7天雛鴨精神狀態(tài)、采食飲水、生活習(xí)性等均正常,剖檢感染鴨未見心、肝、脾有任何眼觀病變和組織學(xué)病變。運(yùn)用突變株Yb2ΔbioF制備弱毒活疫苗免疫櫻桃谷鴨,不僅能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗血清2型RA的特異性抗體,同時(shí)能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的Th1類與Th2類細(xì)胞因子,表明疫苗免疫后顯著地引起了細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,雛鴨經(jīng)一次免疫和二次免疫后,均可獲得較好的針對(duì)RA強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)力,其中,雛鴨經(jīng)一次免疫后對(duì)Yb2強(qiáng)毒攻擊保護(hù)率為90%,經(jīng)兩次免疫后對(duì)Yb2強(qiáng)毒攻擊保護(hù)率高達(dá)100%。本研究結(jié)果表明Yb2ΔbioF可作血清2型RA的弱毒活疫苗候選株。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61
【圖文】：

Fig 1.1 Putative biotin biosynthesis pathway in M. tuberculosis氨基-7 酮基壬酸合成酶（BioF）基-7 酮基壬酸合成酶（KAPAS）又叫做 BioF，是一種 5-磷酸吡哆醛（pyridoxal 5 賴性的轉(zhuǎn)氨酶，主要功能是參與庚二酸單酰-CoA（或-ACP）的脫羧反應(yīng)，然基壬酸（KAPA）(Lin and Cronan, 2011)。目前已有報(bào)道的 BioF 的同源結(jié)構(gòu)通過(guò)與其他的已知結(jié)構(gòu)的 PLP 依賴性酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn) BioF 與二烷基構(gòu)比較更為接近，因此判斷 BioF 屬于Ⅱ型轉(zhuǎn)氨酶(Lin and Cronan, 2011)。芽孢桿菌中的 BioF 的催化機(jī)制是：ANOS 中的活性中心 Lys236 與 PLP 共價(jià)結(jié)胺(Alexeev et al., 1998; Webster et al., 2000)，然后與PLP結(jié)合，攻擊底物庚二酸oA。除了 Lys236，活性位點(diǎn)殘基 His133，Ser179，Asp204，His207 和 Thr233 也的活性位點(diǎn)。這些殘基在所有物種的 BioF 都是高度保守的(Mann and Ploux, 8-二氨基壬酸合成酶（BioA） 又稱 7，8-二氨基壬酸合成酶（DAPAS）屬于氨基轉(zhuǎn)移酶家族(Schneider and化 SAM 的氮原子轉(zhuǎn)移給 KAPA，最終成為生物素的 N7 分子。DAPAS 催化的圖 1.1 分枝桿菌中生物素的合成途徑

CR 擴(kuò)增突變株 Yb2ΔbioF erm F _RS09170 基因片段；泳道 3：PCRrRNA 基因片段of mutant strain and complementatLane 1: The erm F and R. anatipestifefragment of ermF or a 496-bp fragme were amplified from the wild strain Ynt of RA 16S rRNA. Lane 3: The biotrain cYb2ΔbioF , showing a 1158-bfragment of RA 16S rRNA.列比對(duì)以及保守氨基酸的分析.2A），在NCBI中進(jìn)行R鴨疫里圖 2.1 鑒定突變株與回復(fù)

A: PCR 鑒定 bioF 的保守性 M：DNA Marker DM2000；泳道 1-5;血清 1 型菌株 GTB1、GTB2、CQ1、CQ3、NJ4；泳道 6-10：血清 2 型菌株 GDO-3、JY1、JY2、NJ3、SC2；泳道 11-15：血清 10 型菌株 GDO-1、HXb2、YXb1、YXb11、YXL1；泳道 16-20：血清 15 型菌株 SQ007、SQ003、SQ004、YGT002、馬 001；泳道 16-20：未定型菌株 GDO6、GDO-、G46、G77、JY-6；泳道 26：陰性對(duì)照；泳道 27：陽(yáng)性對(duì)照 Yb2B: 預(yù)測(cè) bioF 編碼蛋白 ANOS 與 PDB 中已知 ANOS 序列比對(duì)分析。從 Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索已知 ANOS 晶體結(jié)構(gòu)的序列。[伯克霍爾德氏菌(pdb5JAY)，假鼻疽桿菌(pdb4IW7)，大腸桿菌(pdb1DJE)，伯克霍爾德氏菌(pdb5VNX)，結(jié)核分枝桿菌(pdb3WY7)] C: bioF 多序列比對(duì)。所有序列中嚴(yán)格保守的殘基用黑色框起來(lái)。形成保守的吡哆醛5'-磷酸結(jié)合口袋的殘基用黑色倒三角（G97，Y98，N101，E168，D197，H200，T228 和 K231）表示。Fig. 2.2 The identification the conserved bioF genes(A)PCR identification the conserved bioF genes M: DNA Marker DM2000; Lanes 1-5; Serotype 1 strains GTB1, GTB2,CQ1, CQ3, NJ4; Lanes 6-10: Serotype 2 strains GDO-3, JY1, JY2, : Serotype 10 Strain GDO-1, HXb2, YXb1, YXb11,YXL1; Lanes 16-20: Serotype 15 Strain SQ007, SQ003, SQ004, YGT002, G46, G77, JY-6; lane 26: negative control;lane 27: positive control Yb2 strain.(B) Identity and divergence analysis of predicted ANOS from R. anatipestifer and other known 8-amino-7-oxononanoatesynthase. The crystallized 8-amino-7-oxononanoate synthase sequences [Paraburkholderia xenovorans (pdb5JAY),圖 2.2 bioF 基因的保守性

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2757926