本文關(guān)鍵詞：禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及其表達(dá)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禾谷縊管蚜Rhopalosiphum padi(L.)屬于昆蟲綱半翅目(Hemiptera)、蚜科(Aphididae),是具有刺吸式口器的重要麥類害蟲之一,廣泛分布于世界各地。該蟲刺吸小麥汁液,使小麥不能灌漿或籽粒不飽滿,造成千粒重下降,而且傳播大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV),每年給世界各地的小麥生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。化學(xué)殺蟲劑噴施是防治禾谷縊管蚜的主要方法,長期大量使用化學(xué)殺蟲劑已經(jīng)導(dǎo)致該蟲對多種殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性,面對強(qiáng)大的殺蟲劑選擇壓力,蚜蟲通過基因突變、基因擴(kuò)增、代謝酶活力改變等機(jī)制產(chǎn)生快速的進(jìn)化與適應(yīng)。已有研究表明,ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為一種外排泵,其基因表達(dá)量上升可以降低細(xì)胞內(nèi)部外源物質(zhì)的有效濃度,導(dǎo)致昆蟲對藥劑的敏感性下降。本研究克隆得到禾谷縊管蚜部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的全長序列并進(jìn)行了生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析,同時研究了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米對農(nóng)藥的增效作用,分析了禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在殺蟲劑抗性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用,研究結(jié)果對于深入闡明禾谷縊管蚜對殺蟲劑的抗性機(jī)制具有重要意義。1.禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及其生物信息學(xué)分析本研究采用RT-PCR與RACE技術(shù)克隆獲得了14個ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Rhpa ABCA3,Rhpa ABCB6,Rhpa ABCB7,Rhpa ABCB10,Rhpa ABCC1,Rhpa ABCG1,Rhpa ABCG4,Rhpa ABCG4-1,Rhpa ABCG5,Rhpa ABCG9,Rhpa ABCG20,Rhpa ABCG23,Rhpa ABCG23-1和Rhpa ABCG23-2 c DNA全序列,其中Rhpa ABCG4和Rhpa ABCG4-1與Rhpa ABCG23,Rhpa ABCG23-1和Rhpa ABCG23-2可能是選擇性剪切導(dǎo)致的異構(gòu)體。14個基因的開放閱讀框長度依次分別為5 837,2 818,2 337,1 812,5 463,3 074,2 678,2 443,2 437,2 924,3 872,2 383,2 432和2 256 bp,分別編碼1 635,839,683,603,1 514,616,709,629,638,700,811,693,695和686個氨基酸。在NCBI上Blastp分析發(fā)現(xiàn),這14個基因編碼的氨基酸序列與豌豆蚜Acyrthosiphon pisum和麥雙尾蚜Diuraphis noxia對應(yīng)基因編碼的氨基酸序列一致性最高,達(dá)到90%以上。結(jié)構(gòu)分析表明,14個蛋白均具有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族典型的結(jié)構(gòu)特征,說明其均為禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因。通過ORF finder在線軟件分析顯示,各個基因均具有一個完整的開放閱讀框。在系統(tǒng)進(jìn)化樹上,14個ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與豌豆蚜和麥雙尾蚜各對應(yīng)蛋白距離最近;禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分別位于系統(tǒng)發(fā)育樹的兩大支,其中A家族和G家族聚在其中一支,B家族和C家族聚在另外一支;G家族中G20和G23,G1和G4的進(jìn)化關(guān)系較近,G20和G23位于其中一小支,G1和G4位于另一小支。2.禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)模式分析本研究采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù),對禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Rhpa ABCC1,Rhpa ABCG9,Rhpa ABCG20和Rhpa ABCG23在不同品系中的相對表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果顯示禾谷縊管蚜Rhpa ABCC1,Rhpa ABCG9,Rhpa ABCG20和Rhpa ABCG23在禾谷縊管蚜不同品系中均有不同程度的表達(dá);本研究檢測并分析了這4個基因在禾谷縊管蚜1-4齡若蚜和無翅成蚜的表達(dá)變化,結(jié)果顯示這4個基因在禾谷縊管蚜整個發(fā)育歷期均有表達(dá),但這4個基因在不同發(fā)育時期表達(dá)的變化規(guī)律不同;為了明確禾谷縊管蚜多藥耐藥相關(guān)蛋白Rhpa ABCC1在禾谷縊管蚜不同組織的特異性表達(dá)分析,本研究檢測并分析了禾谷縊管蚜無翅成蚜足,表皮,頭部和中腸的特異性表達(dá),結(jié)果顯示Rhpa ABCC1在無翅成蚜4個不同組織中均有不同程度的表達(dá),其中中腸表達(dá)量最高,為足的4.49倍;此外,本研究檢測并分析了禾谷縊管蚜敏感種群在毒死蜱和吡蟲啉藥劑致死中濃度LC50處理12h、24 h、36 h和48 h后Rhpa ABCC1的相對表達(dá)量變化,研究結(jié)果表明,兩種藥劑處理后,禾谷縊管蚜Rhpa ABCC1均上調(diào)表達(dá),其中吡蟲啉處理48 h后的相對表達(dá)量與敏感品系差異顯著。3.ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米對殺蟲劑增效作用的研究為了確定禾谷縊管蚜對殺蟲劑的抗性是否由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo),我們分別單獨(dú)使用殺蟲劑和殺蟲劑與維拉帕米的結(jié)合使用對禾谷縊管蚜進(jìn)行生物測定。結(jié)果顯示,在終濃度為500μM的維拉帕米下,毒死蜱,異丙威,吡蟲啉和氯氟氰菊酯的毒力分別增加2.72倍,1.40倍,1.64倍和1.50倍。此外,在終濃度為500μM的維拉帕米下,毒死蜱和吡蟲啉在相應(yīng)藥劑抗性品系中的毒力分別增加1.33倍和1.26倍。
【關(guān)鍵詞】：禾谷縊管蚜 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 基因克隆 表達(dá)分析 殺蟲劑抗性 維拉帕米增效
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.12
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-30
• 1.1 禾谷縊管蚜12
• 1.2 昆蟲對殺蟲劑的抗性機(jī)理12-16
• 1.2.1 代謝抗性的分子生物學(xué)機(jī)制12-14
• 1.2.2 靶標(biāo)抗性的分子生物學(xué)機(jī)制14-16
• 1.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其介導(dǎo)的農(nóng)藥跨膜運(yùn)輸16-29
• 1.3.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制16-19
• 1.3.2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族及其生理功能19-21
• 1.3.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在殺蟲劑抗性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用21-22
• 1.3.4 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑22-29
• 1.4 研究目的與意義29-30
• 第二章 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及其生物信息學(xué)分析30-53
• 2.1 材料與方法30-34
• 2.1.1 供試?yán)ハx30
• 2.1.2 主要試劑及儀器30
• 2.1.3 RNA提取30-31
• 2.1.4 c DNA第一鏈的合成31
• 2.1.5 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因全長的克隆31-34
• 2.1.6 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的序列分析及分子進(jìn)化樹的構(gòu)建34
• 2.2 結(jié)果與分析34-50
• 2.2.1 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與序列分析34-44
• 2.2.2 分子系統(tǒng)進(jìn)化分析44-50
• 2.3 討論50-53
• 第三章 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)模式分析53-63
• 3.1 材料與方法53-56
• 3.1.1 供試?yán)ハx53-54
• 3.1.2 主要試劑54
• 3.1.3 主要儀器54
• 3.1.4 禾谷縊管蚜不同發(fā)育階段RNA提取54
• 3.1.5 禾谷縊管蚜無翅成蚜不同組織RNA提取54
• 3.1.6 禾谷縊管蚜抗性品系和敏感品系RNA提取54
• 3.1.7 禾谷縊管蚜藥劑誘導(dǎo)處理RNA提取54
• 3.1.8 實(shí)時熒光定量PCR的引物設(shè)計54-55
• 3.1.9 實(shí)時熒光定量PCR檢測不同處理的禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的相對表達(dá)量55
• 3.1.10 數(shù)據(jù)分析55-56
• 3.2 結(jié)果與分析56-60
• 3.2.1 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因不同發(fā)育時期相對表達(dá)量分析56-57
• 3.2.2 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Rhpa ABCC1不同組織相對表達(dá)量分析57
• 3.2.3 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因不同品系相對表達(dá)量分析57-59
• 3.2.4 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Rhpa ABCC1吡蟲啉和毒死蜱誘導(dǎo)不同時間的相對表達(dá)量分析59-60
• 3.3 討論60-63
• 第四章 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米對殺蟲劑的增效作用63-67
• 4.1 材料與方法63-64
• 4.1.1 供試?yán)ハx63
• 4.1.2 供試藥劑63
• 4.1.3 生物測定63-64
• 4.1.4 數(shù)據(jù)分析64
• 4.2 結(jié)果與分析64
• 4.3 討論64-67
• 第五章 結(jié)論與展望67-69
• 參考文獻(xiàn)69-81
• 致謝81-82
• 作者簡介82

【參考文獻(xiàn)】

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