發(fā)布時(shí)間：2020-06-28 06:03

【摘要】：目的:位于人類21號(hào)染色體上的ETS2基因,在唐氏綜合征(DS)中為三體型。多種DS動(dòng)物及細(xì)胞模型提示ETS2基因高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致DS相關(guān)的骨骼發(fā)育異常,神經(jīng)細(xì)胞凋亡,轉(zhuǎn)錄激活A(yù)PP基因,及白血病高發(fā),而對(duì)實(shí)體腫瘤的發(fā)生卻有抑制作用。ETS2基因雖然在DS病人中為三體型,但是其表達(dá)量遠(yuǎn)高于1.5倍。本研究以人類ETS2基因?yàn)檠芯繉?duì)象,主要研究核轉(zhuǎn)錄因子Sp1對(duì)ETS2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其分子機(jī)制。材料和方法:引物設(shè)計(jì),熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建,細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染,熒光素酶活性檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析,核蛋白提取,凝膠電泳遷移率分析,實(shí)時(shí)熒光定量PCR,蛋白質(zhì)免疫印跡。結(jié)果:1.以ETS2基因第一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的第一個(gè)外顯子的第一個(gè)堿基為+1,成功克隆ETS2基因啟動(dòng)子區(qū)-1058至+132共1191bp DNA序列,將其插入載體pGL4.10構(gòu)建重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pETS2-A,通過(guò)分別固定5’端和3’端進(jìn)行刪切得到不同長(zhǎng)度質(zhì)粒。熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示-748/+132至-748/+48有正性調(diào)控區(qū)域。2.轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn),+48至+132啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)有多個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)。3.將軟件評(píng)分最高的Sp1位點(diǎn)突變,突變型質(zhì)粒(pETS2-A Mut)轉(zhuǎn)染HEK293和SH-SY5Y細(xì)胞,熒光素酶活性下降40%(p0.05)。4.電泳遷移率分析提示ETS2基因啟動(dòng)子+40至+70bp為一個(gè)具有功能活性的Sp1位點(diǎn)。5.質(zhì)粒pETS2-A與pCGN-Sp1共轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示熒光素酶活性分別在HEK293細(xì)胞系和SH-SY5Y細(xì)胞系中升高了2.37倍(p0.05)和2.5倍(p0.05)。6.在HEK293細(xì)胞系和SH-SY5Y細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Sp1,ETS2基因mRNA表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.43倍(p0.05)和1.39倍(p0.05)。7.在HEK293細(xì)胞系和SH-SY5Y細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Sp1,ETS2蛋白水平分別是對(duì)照組的2.74倍(p0.0001)和1.96倍(p0.001)。將HeLa細(xì)胞系中的Sp1敲低后,ETS2蛋白水平表達(dá)減少。結(jié)論:ETS2基因在-1058/+132區(qū)域有顯著啟動(dòng)子活性,且該區(qū)域存在Sp1功能結(jié)合位點(diǎn)。Sp1能明顯上調(diào)ETS2 mRNA和蛋白水平。目的:研究肌肽(Carnosine,CAR)對(duì)四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響。材料和方法:30只ICR小鼠被隨機(jī)均分為對(duì)照組、CCl4模型組和CAR組。除對(duì)照組外,模型組和CAR組均以10 m L/kg劑量的0.2%CCl4花生油溶液灌胃,建立肝損傷模型。造模后CAR組連續(xù)7天給予300 mg/kg肌肽干預(yù)。第8天采血測(cè)定各組血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、白蛋白(Albumin,ALB)和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Glutamyltranspeptidase,GGT)水平,同時(shí)HE染色觀察肝組織病理變化,ELISA檢測(cè)超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性和谷胱甘肽(Glutathion,GSH)及丙二醛(Malonaldehyde,MDA)的含量變化,Western blot檢測(cè)環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和血紅素氧合酶1(Heineoxygenase-1,HO-1)的表達(dá);RT-PCR檢測(cè)炎癥因子白介素1β(Interleukin1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)和白介素10(Interleukin 10,IL-10)的水平。結(jié)果:與模型組相比,經(jīng)肌肽干預(yù)后,CAR組小鼠血清中ALT、AST和GGT水平下調(diào)明顯(t=5.776,P=0.000;t=7.443,P=0.000;t=4.548,P=0.000),ALB水平回升(t=6.061,P=0.000),肝功指標(biāo)明顯恢復(fù);氧化應(yīng)激標(biāo)記物SOD活性(t=6.818,P=0.000)和GSH含量(t=5.739,P=0.000)增加,MDA含量得以明顯下降(t=6.526,P=0.000);氧化/氧合蛋白酶COX-2表達(dá)降低(t=5.754,P=0.001),但HO-1表達(dá)仍持續(xù)上升(t=2.367,P=0.001);炎癥因子TNF-α(t=7.025,P=0.000)和IL-1β(t=11.963,P=0.000)的m RNA水平獲得明顯下調(diào),IL-10則有明顯增加(t=6.074,P=0.000)。結(jié)論:肌肽可通過(guò)緩解機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)和影響炎癥反應(yīng)水平來(lái)改善和保護(hù)CCl4誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷。結(jié)論:肌肽可通過(guò)緩解機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)和影響炎癥反應(yīng)水平來(lái)改善和保護(hù)CCl4誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R725.9
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 1 ETS2 基因啟動(dòng)子區(qū)不同長(zhǎng)度質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜及其對(duì)應(yīng)的位置示意e 1 The different length promoter of ETS2 gene were coloned into pGL4.10mbers represent the end points of each construct.Arrow shows the directiotranscription.All plasimids were confirmed by enzyme digestion.建的質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒 pCMV-Rluc 共轉(zhuǎn)染至 HEK293 細(xì)胞，檢測(cè)區(qū)不同位置的熒光素酶活性，尋找其功能區(qū)域。結(jié)果顯示：固定切到-1001 時(shí)，活性明顯增加（p<0.05），提示可能存在下調(diào)元件390 時(shí)，活性卻明顯下降，說(shuō)明該區(qū)域存在上調(diào)元件。固定 5’端，間存在正性調(diào)控區(qū)域。熒光素酶檢測(cè)結(jié)果如下圖所示：

3 ETS2 基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)。+1 為第一個(gè)外顯子的第一個(gè)堿基。下劃線的為預(yù)到的轉(zhuǎn)錄因子。igure 3 The sequence of the human ETS2 gene promoter from-1058 to +132.The underlinucleotides represent putative transcription factors.轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Sp1 可能參與調(diào)控 ETS2 啟動(dòng)子活性，為進(jìn)一步證作用，將 ETS2 啟動(dòng)子+48/+104 區(qū)域下劃線的 Sp1 位點(diǎn)突變掉，構(gòu)建 pETS變型雙熒光酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pETS2-A-Mut）。將野生型 pETS2-A 及其突變TS2-A-Mut 轉(zhuǎn)染 HEK293 和 SH-SY5Y 細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。HEK293 細(xì)，突變型啟動(dòng)子活性下降了 40%（圖 4A），SH-SY5Y 細(xì)胞中，突變型活性也下降（圖 4B）。結(jié)果說(shuō)明 Sp1 可以調(diào)控 ETS2 基因啟動(dòng)子活性，突變位點(diǎn)及具果如下圖所示：

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 沙皖;陳路佳;盧海波;胡曉藝;胡正波;;腦苷肌肽的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];中國(guó)藥業(yè);2014年08期

2 沈杰;劉超;陳鈞輝;;肌肽在醫(yī)藥方面的研究進(jìn)展[J];中國(guó)生化藥物雜志;2008年02期

本文編號(hào)：2732650