【摘要】：目的:位于人類21號染色體上的ETS2基因,在唐氏綜合征(DS)中為三體型。多種DS動物及細胞模型提示ETS2基因高表達會導致DS相關的骨骼發(fā)育異常,神經(jīng)細胞凋亡,轉錄激活APP基因,及白血病高發(fā),而對實體腫瘤的發(fā)生卻有抑制作用。ETS2基因雖然在DS病人中為三體型,但是其表達量遠高于1.5倍。本研究以人類ETS2基因為研究對象,主要研究核轉錄因子Sp1對ETS2基因的轉錄調控及其分子機制。材料和方法:引物設計,熒光素酶報告基因質粒構建,細胞培養(yǎng)與轉染,熒光素酶活性檢測及數(shù)據(jù)分析,核蛋白提取,凝膠電泳遷移率分析,實時熒光定量PCR,蛋白質免疫印跡。結果:1.以ETS2基因第一個轉錄本的第一個外顯子的第一個堿基為+1,成功克隆ETS2基因啟動子區(qū)-1058至+132共1191bp DNA序列,將其插入載體pGL4.10構建重組熒光素酶報告基因質粒pETS2-A,通過分別固定5’端和3’端進行刪切得到不同長度質粒。熒光素酶活性檢測結果顯示-748/+132至-748/+48有正性調控區(qū)域。2.轉錄因子預測軟件分析發(fā)現(xiàn),+48至+132啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)有多個Sp1結合位點。3.將軟件評分最高的Sp1位點突變,突變型質粒(pETS2-A Mut)轉染HEK293和SH-SY5Y細胞,熒光素酶活性下降40%(p0.05)。4.電泳遷移率分析提示ETS2基因啟動子+40至+70bp為一個具有功能活性的Sp1位點。5.質粒pETS2-A與pCGN-Sp1共轉染,結果顯示熒光素酶活性分別在HEK293細胞系和SH-SY5Y細胞系中升高了2.37倍(p0.05)和2.5倍(p0.05)。6.在HEK293細胞系和SH-SY5Y細胞系中過表達Sp1,ETS2基因mRNA表達水平分別是對照組的1.43倍(p0.05)和1.39倍(p0.05)。7.在HEK293細胞系和SH-SY5Y細胞系中過表達Sp1,ETS2蛋白水平分別是對照組的2.74倍(p0.0001)和1.96倍(p0.001)。將HeLa細胞系中的Sp1敲低后,ETS2蛋白水平表達減少。結論:ETS2基因在-1058/+132區(qū)域有顯著啟動子活性,且該區(qū)域存在Sp1功能結合位點。Sp1能明顯上調ETS2 mRNA和蛋白水平。目的:研究肌肽(Carnosine,CAR)對四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)誘導的化學性肝損傷小鼠氧化應激和炎癥反應的影響。材料和方法:30只ICR小鼠被隨機均分為對照組、CCl4模型組和CAR組。除對照組外,模型組和CAR組均以10 m L/kg劑量的0.2%CCl4花生油溶液灌胃,建立肝損傷模型。造模后CAR組連續(xù)7天給予300 mg/kg肌肽干預。第8天采血測定各組血清中谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、白蛋白(Albumin,ALB)和谷氨酰轉肽酶(Glutamyltranspeptidase,GGT)水平,同時HE染色觀察肝組織病理變化,ELISA檢測超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性和谷胱甘肽(Glutathion,GSH)及丙二醛(Malonaldehyde,MDA)的含量變化,Western blot檢測環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和血紅素氧合酶1(Heineoxygenase-1,HO-1)的表達;RT-PCR檢測炎癥因子白介素1β(Interleukin1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)和白介素10(Interleukin 10,IL-10)的水平。結果:與模型組相比,經(jīng)肌肽干預后,CAR組小鼠血清中ALT、AST和GGT水平下調明顯(t=5.776,P=0.000;t=7.443,P=0.000;t=4.548,P=0.000),ALB水平回升(t=6.061,P=0.000),肝功指標明顯恢復;氧化應激標記物SOD活性(t=6.818,P=0.000)和GSH含量(t=5.739,P=0.000)增加,MDA含量得以明顯下降(t=6.526,P=0.000);氧化/氧合蛋白酶COX-2表達降低(t=5.754,P=0.001),但HO-1表達仍持續(xù)上升(t=2.367,P=0.001);炎癥因子TNF-α(t=7.025,P=0.000)和IL-1β(t=11.963,P=0.000)的m RNA水平獲得明顯下調,IL-10則有明顯增加(t=6.074,P=0.000)。結論:肌肽可通過緩解機體氧化應激狀態(tài)和影響炎癥反應水平來改善和保護CCl4誘導的化學性肝損傷。結論:肌肽可通過緩解機體氧化應激狀態(tài)和影響炎癥反應水平來改善和保護CCl4誘導的化學性肝損傷。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R725.9
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文 1 ETS2 基因啟動子區(qū)不同長度質粒的酶切鑒定圖譜及其對應的位置示意e 1 The different length promoter of ETS2 gene were coloned into pGL4.10mbers represent the end points of each construct.Arrow shows the directiotranscription.All plasimids were confirmed by enzyme digestion.建的質粒和內參質粒 pCMV-Rluc 共轉染至 HEK293 細胞，檢測區(qū)不同位置的熒光素酶活性，尋找其功能區(qū)域。結果顯示：固定切到-1001 時，活性明顯增加（p<0.05），提示可能存在下調元件390 時，活性卻明顯下降，說明該區(qū)域存在上調元件。固定 5’端，間存在正性調控區(qū)域。熒光素酶檢測結果如下圖所示：

3 ETS2 基因啟動子區(qū)轉錄因子預測。+1 為第一個外顯子的第一個堿基。下劃線的為預到的轉錄因子。igure 3 The sequence of the human ETS2 gene promoter from-1058 to +132.The underlinucleotides represent putative transcription factors.轉錄因子預測結果顯示，Sp1 可能參與調控 ETS2 啟動子活性，為進一步證作用，將 ETS2 啟動子+48/+104 區(qū)域下劃線的 Sp1 位點突變掉，構建 pETS變型雙熒光酶報告基因質粒（pETS2-A-Mut）。將野生型 pETS2-A 及其突變TS2-A-Mut 轉染 HEK293 和 SH-SY5Y 細胞，檢測熒光素酶活性。HEK293 細，突變型啟動子活性下降了 40%（圖 4A），SH-SY5Y 細胞中，突變型活性也下降（圖 4B）。結果說明 Sp1 可以調控 ETS2 基因啟動子活性，突變位點及具果如下圖所示：

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 沙皖;陳路佳;盧海波;胡曉藝;胡正波;;腦苷肌肽的臨床應用進展[J];中國藥業(yè);2014年08期

2 沈杰;劉超;陳鈞輝;;肌肽在醫(yī)藥方面的研究進展[J];中國生化藥物雜志;2008年02期

本文編號：2732650