【摘要】：轉(zhuǎn)錄因子Msn4是典型的C2H2型鋅指蛋白,是真菌細(xì)胞調(diào)控外界逆境脅迫應(yīng)答的主要轉(zhuǎn)錄因子,在真菌細(xì)胞的饑餓脅迫、鹽脅迫、氧化脅迫、高滲透壓脅迫以及低溫脅迫等的應(yīng)答調(diào)節(jié)中具有重要的作用,但是未見(jiàn)有報(bào)道研究轉(zhuǎn)錄因子Msn4與真菌多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids;PUFA)低溫合成的關(guān)系。我們前期的研究表明產(chǎn)油酵母—紅冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235,在低溫條件下細(xì)胞膜膜脂中的PUFA含量增加,促進(jìn)了菌株的低溫生長(zhǎng)適應(yīng)性,但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。本研究擬以紅冬孢酵母YM25235菌株的Msn4同源基因—RkMsn4出發(fā),研究其對(duì)YM25235菌株低溫生長(zhǎng)適應(yīng)性和PUFA低溫合成的影響。首先,對(duì)15℃低溫條件下YM25235菌株中基因RkMsn4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及低溫條件培養(yǎng)下的紅冬孢酵母YM25235菌株的甘油含量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,15℃條件下培養(yǎng)1小時(shí)RkMsn4基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平開(kāi)始提高,培養(yǎng)8h RkMsn4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平是30℃條件下mRNA轉(zhuǎn)錄水平的1.41倍,隨著低溫培養(yǎng)時(shí)間的增加Rk Msn4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加,同時(shí)甘油的含量也明顯增加。這些結(jié)果初步表明,RkMsn4基因可能與紅冬孢酵母YM25235菌株的低溫生長(zhǎng)適應(yīng)性有關(guān)。對(duì)RkMsn4基因進(jìn)行克隆與序列分析,結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增得到的片段包含一個(gè)大小為2625 bp的完整開(kāi)放閱讀框,編碼874個(gè)氨基酸,編碼蛋白分子量大小為94.5kD。序列分析發(fā)現(xiàn)RkMsn4基因編碼的氨基酸中存在具有Msn4蛋白類(lèi)似的高度保守的Zn F-C2H2結(jié)構(gòu)域、蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)、Fungal_trans結(jié)構(gòu)域以及CHAD結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果顯示,RkMsn4基因編碼的氨基酸序列與粘紅酵母的Msn4基因編碼的氨基酸序列相同性(identity)為99%的,與白冬孢酵母的Msn4基因編碼的氨基酸序列相同性為70%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示RkMsn4基因編碼的氨基酸序列與紅酵母類(lèi)Msn4蛋白氨基酸序列的親緣關(guān)系更近。這些結(jié)果表明我們克隆得到的RkMsn4基因是一個(gè)潛在的Msn4基因。為了分析RkMsn4基因與紅冬孢酵母YM25235低溫生長(zhǎng)適應(yīng)性和PUFA低溫合成之間的關(guān)系,我們構(gòu)建了RkMsn4基因重組表達(dá)質(zhì)粒pRHRkMsn4,并轉(zhuǎn)化YM25235菌株進(jìn)行過(guò)表達(dá)。環(huán)境脅迫抗性分析結(jié)果表明,RkMsn4基因過(guò)表達(dá)可以明顯提高YM25235菌株中甘油的含量,增強(qiáng)了YM25235菌株對(duì)高滲透壓脅迫、鹽壓脅迫以及低溫脅迫的耐受性。進(jìn)一步的脂肪酸GC分析中顯示,15℃培養(yǎng)后,RkMsn4基因過(guò)表達(dá)的YM25235菌株中亞油酸(Linoleic acid;LA)和α-亞麻酸(α-Linolenic acid;ALA)的含量分別從對(duì)照菌株中的16.81%和6.14%提高到31.56%和17.32%,而油酸(Oleic acid;OA)的含量明顯減少。進(jìn)一步分析結(jié)果還顯示,RkMsn4基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)了15℃條件下催化油酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)A和ALA的Δ~(12/15)-脂肪酸脫氫酶基因RKD12的mRNA轉(zhuǎn)錄水平提高了2.54倍。這些結(jié)果都可以說(shuō)明,RkMsn4基因過(guò)表達(dá)提高了YM25235菌株中LA和ALA合成相關(guān)基因RKD12的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,增加PUFA的合成量,提高YM25235菌株低溫生長(zhǎng)適應(yīng)性。我們進(jìn)一步通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)分析RkMsn4與RKD12基因啟動(dòng)子序列RKD12P之間的相互作用,揭示轉(zhuǎn)錄因子RkMsn4與RKD12基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平低溫增加之間的關(guān)系。首先克隆RKD12基因上游3617bp序列,序列分析顯示該序列具有真核啟動(dòng)子特征性的序列原件TATA-box、TFIIB識(shí)別元件BRE、起始子initiator、CAAT-box、GC-box和下游啟動(dòng)子元件DPE,以及與環(huán)境脅迫應(yīng)答相關(guān)的應(yīng)激反應(yīng)元件(STRE)、低溫反應(yīng)元件(LTRE)和金屬響應(yīng)元件(MRE)。為了驗(yàn)證其功能,將RKD12P插入載體pRH2304中替換RtGFP基因上游的啟動(dòng)子PRtGPD1,構(gòu)建新的重組質(zhì)粒pRHRKD12PGFP,然后轉(zhuǎn)化YM25235菌株,熒光顯微觀察和Western雜交分析結(jié)果表明RKD12P具有啟動(dòng)子功能。再繼續(xù)將啟動(dòng)子RKD12P與RkMsn4基因插入到酵母單雜交系統(tǒng)中的pAbAi、pGADT7-Rec2質(zhì)粒上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pAbAiRKD12P和pGADT7Rec2RkMsn4并轉(zhuǎn)化釀酒酵母Y1H酵母中,抗性分析表明轉(zhuǎn)錄因子RkMsn4與啟動(dòng)子RKD12P之間發(fā)生相互作用。該結(jié)果表明,低溫條件下RkMsn4基因編碼蛋白可能作為轉(zhuǎn)錄因子與RKD12P相互作用,促進(jìn)RKD12基因的轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步揭示低溫條件下與RkD12基因m RNA的轉(zhuǎn)錄提高相關(guān)的其他調(diào)節(jié)蛋白,我們通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)方法分析低溫條件下與啟動(dòng)子RkD12P結(jié)合的其他核蛋白。將RkD12P進(jìn)行生物素標(biāo)記后與鏈霉親和素磁珠結(jié)合,分別與15℃和30℃條件下培養(yǎng)的YM25235菌株核蛋白進(jìn)行孵育,分離與RkD12P結(jié)合蛋白后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果顯示,共獲得14種核定位蛋白,其中有6種蛋白是15℃和30℃培養(yǎng)樣品中同時(shí)存在,有2種只存在30℃培養(yǎng)樣品中,另有6種只存在于15℃培養(yǎng)樣品中,而且低溫樣品獲得的這6種中有部分蛋白已有報(bào)道與環(huán)境脅迫響應(yīng)有關(guān),其對(duì)RkD12基因低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的影響將在后續(xù)工作中進(jìn)行研究。我們前期分析表明,紅冬孢酵母YM2535是一株產(chǎn)油菌株,同時(shí)合成β-胡蘿卜素、紅酵母素和圓酵母素等類(lèi)胡蘿卜素,因此,本研究也同時(shí)分析了過(guò)表達(dá)RkMsn4基因?qū)M25235菌株合成類(lèi)胡籮卜素和油脂的影響。提取30℃培養(yǎng)的RkMsn4基因過(guò)表達(dá)菌株中的類(lèi)胡籮卜素及油脂分析部分類(lèi)胡蘿卜素及油脂合成相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果表明,RkMsn4基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)了類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平,導(dǎo)致類(lèi)胡籮卜素的含量明顯提高,而與油脂合成相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平雖然提高了,但油脂含量卻小幅度下降,推測(cè)可能與胞內(nèi)乙酰CoA過(guò)多進(jìn)入類(lèi)胡蘿卜素的合成途徑有關(guān)。綜上所述,紅冬孢酵母YM25235的RkMsn4基因過(guò)表達(dá)提高YM25235菌株對(duì)滲透壓脅迫、鹽脅迫以及低溫脅迫的耐受性,還能促進(jìn)低溫下RKD12基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及PUFA合成增加進(jìn)一步提高了YM25235菌株的低溫生長(zhǎng)適應(yīng)性,而且RkMsn4蛋白通過(guò)蛋白質(zhì)-DNA相互作用的方式對(duì)RKD12基因mRNA的低溫轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外,RkMsn4基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)YM25235菌株中類(lèi)胡籮卜素的合成,但引起油脂合成水平下降。本研究結(jié)果將有助于最終揭示紅冬孢酵母YM25235低溫生長(zhǎng)適應(yīng)性機(jī)制、PUFA低溫合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其調(diào)節(jié)機(jī)制、以及RkMsn4蛋白與YM25235菌株油脂和類(lèi)胡籮卜素合成之間的關(guān)系,為進(jìn)一步的相關(guān)理論和應(yīng)用研究打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q935
【圖文】：

大學(xué)碩士學(xué)位論文家族可以增強(qiáng)生物的環(huán)境脅迫耐受性。Msn2 和 Msn4 是典型的 C2[52]。Msn2 和 Msn4 是兩個(gè)同源的主調(diào)節(jié)器，它們?cè)诮湍敢话愕膽?yīng)激演著重要的角色，在不同的壓力條件下轉(zhuǎn)錄了數(shù)百個(gè)基因[53-56]。在釀haromyces cerevisiae）中，（C2H2）2 鋅指轉(zhuǎn)錄因子 Msn2 和 Msn4答元件（STRE：CCCCT）激活基因轉(zhuǎn)錄應(yīng)對(duì)一系列壓力，比如輕度熱滲透脅迫，酒精和弱酸的應(yīng)激反應(yīng)中，發(fā)揮核心中樞的作用[57-59]。壓sn2 和 Msn4 積聚在核內(nèi)[60, 61]，這導(dǎo)致脅迫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄激活是通件的啟動(dòng)子[62, 63]。有研究表明，Msn2 和 Msn4 對(duì)基因誘導(dǎo)的差異有這一調(diào)控的基因和條件都是特異性的[64, 65]。Msn2 和 Msn4 位于一個(gè)核心位置，它涉及眾多的生理和遺傳相互作用，包括各種激酶、磷酸染色質(zhì)重塑物。之前的研究分析了特定的 Msn2 和 Msn4 合作伙伴的要集中在激酶和磷酸酶[60, 66, 67]。

昆明理工大學(xué)碩士學(xué)位論文適應(yīng)性。因此，他們認(rèn)為應(yīng)激條件下 Msn2 和 Msn4 在核內(nèi)積累并與染色質(zhì)結(jié)合，以應(yīng)對(duì)外界的脅迫，提高酵母自身對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性。營(yíng)養(yǎng)素的利用度和壓力影響著細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)狀態(tài)或靜止?fàn)顟B(tài)的，乙酰輔酶 A在營(yíng)養(yǎng)限制條件下刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，但在饑餓脅迫下細(xì)胞如何產(chǎn)生乙酰輔酶 A 尚不清楚。Kuang Z 等[74]研究表明顯示一般應(yīng)激反應(yīng)因子 Msn2 和 Msn4，通過(guò)直接結(jié)合和激活編碼糖酵解酶的基因，起到酵母糖酵解的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用。Msn2和 Msn4 基因缺失的酵母細(xì)胞表現(xiàn)出抑制糖酵解的基因和乙酰輔酶 A 的積累和重新進(jìn)入增長(zhǎng)從靜止期明顯延遲。因此反應(yīng)因子 Msn2 和 Msn4 在激活碳水化合物代謝基因和應(yīng)激反應(yīng)基因中表現(xiàn)出雙重作用，這些結(jié)果表明饑餓誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)因子可能導(dǎo)致靜止細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)物限制時(shí)通過(guò)糖酵解重新進(jìn)入生長(zhǎng)的一種可能機(jī)制。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2732248