【摘要】：實驗?zāi)康?前期研究發(fā)現(xiàn)單一的去雄(AD)或自噬抑制(AI)都能促進(jìn)BPH-1細(xì)胞的凋亡,共同作用后凋亡進(jìn)一步加強(qiáng),在第24H時自噬和凋亡呈現(xiàn)拮抗關(guān)系。本實驗將在去雄且自噬抑制條件下,研究沉默Beclin-1基因?qū)PH-1細(xì)胞自噬水平及凋亡水平的影響,研究沉默Beclin-1基因?qū)KT凋亡通道的調(diào)節(jié),從細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡角度去探索前列腺增生。研究方法:實驗包括正常細(xì)胞組、空載體細(xì)胞組(sh-RNA)、低表達(dá)sh-Beclin-1細(xì)胞組三組。首先通過克隆構(gòu)建、慢病毒包裝、慢病毒感染及嘌呤霉素篩選獲得攜帶空載體BPH-1細(xì)胞系(sh-RNA),低表達(dá)Beclin-1的BPH-1細(xì)胞系(sh-Beclin-1),并采用western blot和qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率。構(gòu)建LC3細(xì)胞自噬腺病毒Adv-LC3-GFP,將正常細(xì)胞、空載體細(xì)胞(sh-RNA)、sh-Beclin-1細(xì)胞培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁(8-12小時),感染LC3細(xì)胞自噬腺病毒48小時,拍照觀察;清除培養(yǎng)基,PBS清洗三次,將各組細(xì)胞于含有10%Charcoal-stripped FBS、50μM chloroquine的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(Phenol Red-free),拍照觀察。將正常細(xì)胞、空載體細(xì)胞(sh-RNA)、低表達(dá)sh-Beclin-1細(xì)胞培養(yǎng)過夜并使細(xì)胞貼壁(8-12小時),PBS清洗三次,再將細(xì)胞于含有10%Charcoal-stripped FBS、50μM chloroquine的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(Phenol Red-free),通過Flow Cytometry法檢測各組細(xì)胞的凋亡水平,提取各實驗組細(xì)胞總蛋白,并通過western blot檢測LC3Ⅱ、PARP-1、Caspase-3、BAX、BCL-2、AKT、P-AKT、m-TOR、β-actin蛋白表達(dá)情況。實驗結(jié)果:(1)western blot、qRT-PCR方法檢測正常對照組、sh-RNA-BPH-1組、sh-Beclin1-BPH-1組Beclin-1蛋白及RNA表達(dá)結(jié)果顯示:正常對照組、sh-RNA-BPH-1組Beclin-1蛋白及RNA表達(dá)無差異,sh-Beclin1-BPH-1組Beclin-1蛋白及RNA表達(dá)則明顯降低。(2)感染LC3細(xì)胞自噬腺病毒48小時,拍照觀察,sh-Beclin-1組與正常對照組、sh-RNA-BPH-1組相比GFP-LC3表達(dá)明顯下調(diào)(P0.001),用含有10%Charcoal-stripped FBS、50μM chloroquine的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(Phenol Red-free),熒光顯微鏡觀察到sh-Beclin1組較正常對照組、sh-RNA組熒光點數(shù)明顯減少(P0.001)。(3)各組細(xì)胞培養(yǎng)過夜,用含有10%Charcoal-stripped FBS、50μM chloroquine的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(Phenol Red-free),采用Flow Cytometry法檢測各組細(xì)胞凋亡水平,發(fā)現(xiàn)sh-Beclin1-BPH-1組細(xì)胞凋亡率較正常對照組、sh-RNA-BPH-1組明顯升高(P0.01)。(4)western blot檢測各組相關(guān)蛋白表達(dá)水平,sh-Beclin1-BPH-1組中LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平較正常細(xì)胞組、sh-RNA組明顯下調(diào);(5)sh-Beclin1-BPH-1組PARP-1蛋白表達(dá)水平下降并產(chǎn)生裂解片段、Caspase-3蛋白表達(dá)水平下調(diào);(6)sh-Beclin1-BPH-1組BCL-2表達(dá)下調(diào)并BAX蛋白表達(dá)上調(diào)、BCL2/BAX比值降低;(7)正常對照組、sh-RNA-BPH-1組、sh-Beclin1-BPH-1三組中蛋白AKT表達(dá)無明顯差異,但sh-Beclin1-BPH-1組P-AKT較前兩組表達(dá)則明顯降低,且m-TOR蛋白的表達(dá)則明顯上調(diào)。實驗結(jié)論:Chloroquine能有效的抑制BPH-1細(xì)胞的自噬程度;在去雄且自噬抑制條件下,沉默Beclin-1基因可以進(jìn)一步降低前列腺增生上皮細(xì)胞BPH-1的自噬強(qiáng)度,并活化PARP-1、Caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡誘導(dǎo)蛋白,通過Akt凋亡信號通道促進(jìn)BPH-1細(xì)胞的凋亡;
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R697.3
【圖文】：

胞內(nèi)的受損的細(xì)胞器或者某些大分子物質(zhì)而產(chǎn)生自噬體，自噬體的形成能夠分別否產(chǎn)生；自噬小體進(jìn)一步與溶酶體結(jié)合形成“自噬-溶酶體”（圖 1），溶酶體內(nèi)的白酶則會分解自噬體內(nèi)的物質(zhì)，形成氨基酸、游離脂質(zhì)、糖類等物質(zhì)為細(xì)胞供應(yīng)，所以在多數(shù)情況下自噬對于細(xì)胞而言是一種保護(hù)機(jī)制，但細(xì)胞自噬也可以誘導(dǎo)藥性得出產(chǎn)生以及促腫瘤細(xì)胞生長。

圖 2 Beclin-1 與 PI3K-AKT-mTOR 通路的關(guān)系-TOR 是一種 Ser/Thr 蛋白激酶，類屬 PIKK 家族[34]，對于哺乳動物而言，m-T在 mTORC1 和 mTORC2 兩種復(fù)合物形態(tài)[35]，m-TOR 聯(lián)系著多個信號通路，樞紐的功能，通過對不同信號的識別和整理對糖類、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝，以增殖、分化等生命活動密切相關(guān)。PI3K-Akt-mTOR 通道主要經(jīng)過對 m-TOR控制自噬，m-TOR 也是自噬初期的首要調(diào)控蛋白，對自噬有負(fù)調(diào)控功能[36]，長因子信號調(diào)控下，PI3K-AKT 與 Tyr 激酶受體雜合，活化后的 m-TOR 下調(diào)能AKT 可以激活 mTORC1 與 mTORC2，其中 mTORC1 的激活在能量充沛的溶面產(chǎn)生[38]，mTORC2 則對雷帕霉素并不具敏感性[39]，但激活的 mTORC2 可以揮正性調(diào)控并保存細(xì)胞[40]。該通道調(diào)控多種疾病的發(fā)生、進(jìn)展，本研究將以基因Beclin-1為研究對象去探索該基因?qū)η傲邢僭錾掀ぜ?xì)胞和對該通路的作。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 凌生濤;姚啟盛;柳建軍;陳從波;黃力;王黎;;去勢后阻斷自噬對大鼠前列腺細(xì)胞凋亡的影響[J];國際泌尿系統(tǒng)雜志;2015年04期

2 朱圣生;吳建輝;孫祖越;;良性前列腺增生發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J];毒理學(xué)雜志;2013年05期

本文編號：2724165