【摘要】：水資源愈來愈匱乏導(dǎo)致干旱成為制約植物生長發(fā)育的重要因素之一,在這種環(huán)境下甜高粱因為其抗旱能力強(qiáng)、生物產(chǎn)量高、含糖量高被作為優(yōu)質(zhì)的能源植物重點研究。目前對于甜高粱的研究大多處于生理生化水平,對其分子水平上的研究較少。WRKY(N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列)轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、生物與非生物脅迫應(yīng)答等多種過程。本文從克隆甜高粱中WRKY基因入手,從分子水平上研究其抗旱機(jī)理,為甜高粱抗旱基因的研究打下基礎(chǔ)。以甜高粱品種遼甜一號為試驗材料,設(shè)置0%、10%、20%三個濃度梯度用PEG6000模擬干旱,同時設(shè)置12 h、24 h、48 h三個時間梯度。利用巢式PCR技術(shù)克隆兩個甜高粱WRKY基因全長cDNA,命名為SSWRKY28和SSWRKY76。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示兩個基因編碼的蛋白均具有WRKY核心序列“WRKYGQK”和“C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H”鋅指結(jié)構(gòu)模型。SSWRKY28 cDNA序列全長1179 bp,包括1個1029 bp的開放閱讀框,編碼342個氨基酸,蛋白分子式為C_(1592)H_(2579)N_(495)O_(499)S_(10),預(yù)測其蛋白分子量為36958.61,等電點(PI)為9.38。SSWRKY76 cDNA序列全長1012 bp,包括1個984 bp的開放閱讀框,編碼327個氨基酸,蛋白分子式為C_(1471)H_(2394)N_(442)O_(501)S_(13)預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為234704.63,等電點(PI)為6.46。疏水性檢測兩個蛋白都屬于親水性蛋白。序列同源性比較,系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,SSWRKY28蛋白與高粱、玉米和谷子WRKY蛋白親緣關(guān)系較近,SSWRKY76蛋白與高粱、稷草和玉米WRKY蛋白親緣關(guān)系較近。實時熒光定量PCR分析表明,隨著干旱脅迫時間延長,甜高粱SSWRKY28和SSWRKY76在0 h到24 h呈下調(diào)表達(dá)趨勢,24 h后到48 h又開始上調(diào)表達(dá)。由此推測甜高粱基因SSWRKY28和SSWRKY76基因可能在響應(yīng)應(yīng)答干旱脅迫時發(fā)揮一定的作用。選擇SSWRKY28構(gòu)建重組SSWRKY28::pHBT-GFP擬南芥原生質(zhì)體表達(dá)體系進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位分析,激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察,顯示SSWRKY28蛋白定位在了細(xì)胞質(zhì)中,SSWRKY28可能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)調(diào)控植物應(yīng)答響應(yīng)干旱脅迫。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S566.5
【圖文】：

圖 1-1 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中的應(yīng)答反應(yīng)圖[35]Fig. 1-1 Response of WRKY transcription factor in abiotic stress[35]RKY 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控非生物脅迫的機(jī)理 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子涉及各種激素信號網(wǎng)絡(luò)[36]，受到外源激素 子誘導(dǎo)時，能調(diào)控信號途徑下游基因的表達(dá)。其中 WRKY 轉(zhuǎn)錄中的一個重要組分，能作為一種轉(zhuǎn)錄激活子或轉(zhuǎn)錄抑制子加[37]。研究報道 WRKY25 和 WRKY33 在 SA 和 JA 信號調(diào)控網(wǎng)并激活 JA 信號途徑[38]�；罨鞍准っ福∕itogen-activated protein kinases，MAPK），生物中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，能夠?qū)⑼饨缧盘柾ㄟ^一系列的，在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用[39]，在 MAPK 信

GAGCACAACCACCCGAGCCCGACGCGCGCCGGCGAGCTCCCCAGCGCCE H N H P S P T R A G E L P S AGCCAGCGGGCCCGTGCCGTGCTCAATCTCCATCAACTCCTCCGGCCCGA S G P V P C S I S I N S S G PGACCTCACCAAGAACGGAGGGGGCGGCGGCGTGCGGGTGCTCGACGCCD L T K N G G G G G V R V L D AGACCTCAAGAAGCTGTGCCAGGAGATCGCGTCGCCGGATTTCCGGACGD L K K L C Q E I A S P D F R TCAGATGGCGCGCTCGCTGACCAGCGATTCCAAGTTCACCCACGCGCTGQ M A R S L T S D S K F T H A LCTGCAGCAGCTGCCGGAGTACTAGTGCCTAGCCGTTCCTL Q Q L P E Y 圖 3-2 SSWRKY76 cDNA 序列及推導(dǎo)的氨基酸序列TG 為起始密碼子，TAG 為終止密碼子；“WRKYGQK”為 WRKY有的保守結(jié)構(gòu)域，C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H 為鋅指結(jié)構(gòu)。RKY76 cDNA sequences and deduced amino acid sequences from doc horizontal line means the initiator codon, TAG means termination code sequence of WRKY, “C-X4-5-C-X22-23-HX1-H” is zinc finger struc

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