【摘要】：萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)是一種環(huán)境友好型生防真菌,可在自然環(huán)境中侵染多種鱗翅目害蟲而被用作新型生物殺蟲劑。但萊氏野村菌發(fā)酵生產(chǎn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求特殊、產(chǎn)孢條件苛刻,生產(chǎn)周期長(zhǎng),生產(chǎn)成本高等,限制了萊氏野村菌的規(guī)模化生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用。經(jīng)長(zhǎng)期研究,本實(shí)驗(yàn)室成功經(jīng)液體發(fā)酵誘導(dǎo)萊氏野村菌微菌核,由于微菌核具有生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)成本較低、產(chǎn)品便于儲(chǔ)存運(yùn)輸、能穩(wěn)定持續(xù)侵染等特點(diǎn),開創(chuàng)了利用真菌微菌核作為傳統(tǒng)分生孢子制劑替代有效成分的新途徑。而從分子層面對(duì)萊氏野村菌微菌核的發(fā)育機(jī)制研究,對(duì)于了解真菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力,指導(dǎo)微菌核發(fā)酵生長(zhǎng)具有重要理論和實(shí)際意義。前期本實(shí)驗(yàn)室對(duì)萊氏野村菌微菌核形成期的比較轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn),在微菌核形成過程中萊氏野村菌Rim15,Ume6與Ime2均有上調(diào)表達(dá),萊氏野村菌微菌核形成過程中孢子萌發(fā)、葡萄糖濃度、菌絲極性生長(zhǎng)及氧脅迫均能影響微菌核的產(chǎn)生。而已有的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),在不同的真菌中,Rim15可整合多種途徑營(yíng)養(yǎng)信號(hào),響應(yīng)葡萄糖濃度,參與孢子形成,而且應(yīng)對(duì)氧脅迫是必須的;Ume6參與菌絲極性生長(zhǎng)和侵染致病力;Ime2參與孢子形成,假菌絲生長(zhǎng)及侵染致病能力。但上述基因在萊氏野村菌中尤其是其對(duì)萊氏野村菌微菌核分化形成尚無相關(guān)報(bào)道。據(jù)此,本研究克隆得到NrRim15,NrUme6與NrIme2基因,通過構(gòu)建敲除菌株對(duì)突變體生理形態(tài)、應(yīng)對(duì)脅迫、微菌核形成及侵染靶標(biāo)致病力進(jìn)行分析,主要獲得以下研究成果:(1)基因克隆與序列分析根據(jù)萊氏野村菌基因組克隆得到NrRim15,NrUme6與NrIme2基因全長(zhǎng)序列,登錄ID分別為OAA39692.1,OAA36838.1與OAA44248.1。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NrRim15開放閱讀框?yàn)?775bp,編碼1924個(gè)氨基酸,蛋白分子量為210.63 KDa,等電點(diǎn)為6.09,無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,含有真菌Rim15-like催化區(qū)域、PKc-like Superfamily蛋白激酶催化區(qū)域和REC信號(hào)接收區(qū)域;NrUme6開放閱讀框?yàn)?839bp,編碼612個(gè)氨基酸,蛋白分子量為67.35 KDa,等電點(diǎn)為8.64,無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,含有GAL4-like蛋白結(jié)合區(qū)域和Fungal~_trans真菌特定轉(zhuǎn)錄因子區(qū)域;NrIme2開放閱讀框?yàn)?322bp,編碼773個(gè)氨基酸,蛋白分子量為85.06 KDa,等電點(diǎn)為9.55,無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,含有STKc~_MAK~_like蛋白激酶催化區(qū)域和PKc~_like Superfamily蛋白激酶催化區(qū)域,同源性比對(duì)和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因均與綠僵菌屬的親緣性高。(2)基因在萊氏野村菌不同發(fā)育階段及不同條件下的表達(dá)模式對(duì)SMAY平板上萊氏野村菌兩型轉(zhuǎn)化不同時(shí)期的樣品進(jìn)行qPCR分析,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因在萊氏野村菌兩型轉(zhuǎn)化中均有不同程度表達(dá)。其中NrRim15和NrIme2在由酵母態(tài)向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)變過程中有較高表達(dá),而NrUme6在兩型轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)量程度較低。在微菌核誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中,NrRim15,NrUme6和NrIme2基因在微菌核形成的各時(shí)期均有表達(dá),前期表達(dá)量較低,在微菌核形成高峰期表達(dá)量均急劇升高,說明3個(gè)基因均參與了微菌核形成。配置10%、50%和90%(添加的量為常規(guī)培養(yǎng)基中葡萄糖量的百分比)葡萄糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)萊氏野村菌微菌核至大量形成期,對(duì)微菌核樣品qPCR定量分析發(fā)現(xiàn),NrRim15,NrUme6和NrIme2在不同葡萄糖濃度下表達(dá)量無顯著差異。(3)基因敲除載體構(gòu)建和突變菌株篩選擴(kuò)增獲得NrRim15,NrUme6與NrIme2基因左右側(cè)翼序列并添加酶切位點(diǎn)。NrRim15左右側(cè)翼引入XhoI(單酶切)和XbaI(單酶切),NrUme6左右側(cè)翼引入EcorI+XhoI(雙酶切)和HindIII(單酶切),NrIme2左右側(cè)翼引入EcoRI(單酶切)和XbaI(單酶切),分析酶切位點(diǎn)的兼容性,選擇最佳順序進(jìn)行連接,以潮霉素作為篩選標(biāo)記,成功獲得靶標(biāo)基因的敲除載體。利用農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行共培養(yǎng),使目的基因與敲除載體發(fā)生同源置換,經(jīng)突變體驗(yàn)證鑒定,篩選出穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子菌株,再通過單孢分離,成功獲得目標(biāo)基因敲除突變菌株,分別命名為△NrRim15,△NrUme6和△NrIme2。(4)突變菌株基礎(chǔ)生長(zhǎng)分析對(duì)3個(gè)突變菌株的培養(yǎng)特性進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),Nr Rim15缺失后延遲了菌株的兩型轉(zhuǎn)換,菌絲變粗變長(zhǎng)并出現(xiàn)異常膨大,產(chǎn)孢量顯著下降;NrIme2缺失嚴(yán)重影響了菌株的生長(zhǎng)速率,菌絲發(fā)育遲緩,密度較大的顆粒物增多,產(chǎn)孢延遲,產(chǎn)孢量較野生型略有下降;NrUme6的缺失相比野生型菌株的培養(yǎng)形狀無顯著變化。所有突變體的孢子在形態(tài)上較野生型無顯著差異,但NrRim15缺失后分生孢子萌發(fā)率比野生型有明顯降低,NrUme6和NrIme2缺失菌株的孢子萌發(fā)率無顯著變化。(5)突變菌株應(yīng)對(duì)不同濃度葡萄糖的生長(zhǎng)分析在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基上(添加的量為常規(guī)培養(yǎng)基中葡萄糖量的百分比),野生型和突變菌株的菌落直徑大小無顯著差別,但菌落形態(tài)上NrRim15突變菌株在10%低濃度葡萄糖碳源時(shí)較野生型兩型轉(zhuǎn)化顯著延遲,產(chǎn)孢量較野生型下降51.25%,而較高濃度(50%和90%)的菌落形態(tài)類似于野生型呈現(xiàn)白色菌絲狀,說明NrRim15在萊氏野村菌響應(yīng)低濃度葡萄糖時(shí)發(fā)揮作用,NrIme2和NrUme6缺失菌株與野生型相比無明顯差異。(6)突變菌株應(yīng)對(duì)脅迫生長(zhǎng)分析離子脅迫中,添加NaCl發(fā)現(xiàn)NrRim15和NrIme2缺失均導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)受限,產(chǎn)孢較基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別下降88%和94.67%;但在添加KCl后,NrRim15和NrIme2缺失菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢均有不同程度恢復(fù),其中產(chǎn)孢分別恢復(fù)92.85%和92.98%;NrUme6缺失菌株在離子脅迫中與野生型差異不明顯。滲透壓脅迫中,△NrRim15在甘油和山梨醇脅迫均發(fā)現(xiàn)菌株正常生長(zhǎng)受抑制,說明NrRim15缺失導(dǎo)致菌株對(duì)滲透壓脅迫的敏感性提高;NrUme6和NrIme2缺失菌株在滲透壓脅迫中菌株生長(zhǎng)發(fā)育較野生型均無明顯變化。3個(gè)突變菌株對(duì)細(xì)胞破壞劑十二烷基磺酸鈉(SDS)和剛果紅均不敏感,僅發(fā)現(xiàn)添加SDS對(duì)NrRim15缺失導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)有較小程度抑制;氧脅迫測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)基中添加過氧化氫和甲萘醌后,△NrRim15與△NrIme2菌株正常生長(zhǎng)均被顯著抑制,產(chǎn)孢量相對(duì)野生型分別下降90.76%和53.84%,添加甲萘醌后兩個(gè)缺失菌株生長(zhǎng)抑制更為強(qiáng)烈,表現(xiàn)對(duì)氧脅迫強(qiáng)烈的不耐受性;NrUme6缺失菌株在氧脅迫條件下生長(zhǎng)發(fā)育與野生型無明顯差異,說明NrRim15和NrIme2基因在萊氏野村菌氧代謝中起著重要作用,而NrUme6基因不參與該過程。(7)突變菌株誘導(dǎo)形成微菌核分析液體誘導(dǎo)野生型和突變菌株微菌核觀察分析。結(jié)果顯示,NrRim15,NrUme6和NrIme2的缺失對(duì)微菌核的正常形成均有不同程度的影響,表現(xiàn)為微菌核形成時(shí)間較野生型顯著延遲,其中△NrRim15菌核直徑變小,致密性和色素沉積降低,微菌核邊緣菌絲長(zhǎng)而豐富,微菌核產(chǎn)量和生物量分別下降61.53%和40.91%;△NrUme6菌核直徑減小,致密性降低,微菌核產(chǎn)量和生物量分別下降23.07%和9.09%;△NrIme2微菌核大小不均,邊緣菌絲短而稀疏,微菌核產(chǎn)量和生物量分別下降10.05%和18.18%。(8)突變菌株生物毒力分析使用斜紋夜蛾三齡幼蟲為侵染靶標(biāo),以體表點(diǎn)滴和體內(nèi)注射測(cè)定野生型和突變型的侵染力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NrRim15和NrIme2缺失后侵染的標(biāo)靶幼蟲的死亡率均低于野生型,體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)△NrRim15突變菌株和△NrIme2突變菌株的半致死時(shí)間比野生型分別延長(zhǎng)5.3d和2.4 d,體表侵染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)△NrRim15突變菌株△NrIme2突變菌株的半致死時(shí)間比野生型分別延長(zhǎng)5.0 d和3.2 d,其中△NrRim15菌株侵染的幼蟲存活率增高更顯著,半致死時(shí)間更長(zhǎng),而△NrUme6菌株半致死時(shí)間與野生型相差不大,表現(xiàn)出與野生型相似的致病力。受NrRim15和NrIme2突變菌株感染的斜紋夜蛾幼蟲后變成僵蟲的過程顯著延遲,由此可見,NrRim15和NrIme2基因缺失導(dǎo)致侵染致病力下降�！鱊rUme6菌株侵染的僵蟲較野生型無明顯差異,說明NrUme6基因與萊氏野村菌對(duì)寄主的毒力無關(guān)。結(jié)論:NrRim15,NrUme6與NrIme2基因在萊氏野村菌菌株生長(zhǎng)發(fā)育中起著不同作用,其中NrRim15,NrIme2參與了菌株的氧代謝過程,對(duì)菌株的兩型轉(zhuǎn)換、菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、抗逆力及對(duì)斜紋夜蛾的毒力均有不同程度的影響,而NrUme6基因幾乎不參與菌株氧代謝,對(duì)菌株兩型轉(zhuǎn)換、菌絲發(fā)育、產(chǎn)孢以及毒力影響不大。3個(gè)基因均影響到微菌核發(fā)育,基因敲除突變體菌株對(duì)微菌核的產(chǎn)量和生物量均有不同程度下降,并且影響到微菌核的形態(tài)。但其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
【圖文】：

2 材料和方法③ 凝膠回收基因側(cè)翼片段：凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增所得目的基因側(cè)翼片段大小的正確性，在確認(rèn)條帶大小正確后，通過 HiPure PCR pure kits 直接純化試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收，或者通過 Axgen 凝膠回收試劑盒回收，至此即完成 3 個(gè)基因的左右側(cè)翼片段擴(kuò)增；④ 基因敲除載體構(gòu)建：將擴(kuò)增的 NrRim15, NrUme6 與 NrIme2 基因側(cè)翼片段經(jīng)酶切后按照酶切位點(diǎn)兼容性，分別連接至敲除載體上的 LB 和 RB 位置，構(gòu)成 3個(gè)目標(biāo)基因的單敲除重組質(zhì)粒（圖 2.1）。

對(duì)應(yīng)的 cDNA 序列祥見文章附錄 Ⅰ。③ 通過開放閱讀框網(wǎng)站預(yù)測(cè)表明 NrRim15 開放閱讀框?yàn)?5775bp，含有 1 個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度為 71bp；NrUme6 開放閱讀框?yàn)?1839bp，含有 1 個(gè)內(nèi)含子，，長(zhǎng)度為93bp；NrIme2 開放閱讀框?yàn)?2322bp，含有 1 個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度為 64bp。3.2 生物信息學(xué)分析① 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)通過生物在線網(wǎng)站對(duì) NrRim15, NrUme6 與 NrIme2 蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，NrRim15 基因編碼 1924 個(gè)氨基酸，蛋白理論分子量為 210.63KDa，等電點(diǎn)為 6.09；NrUme6 基因編碼 612 個(gè)氨基酸，蛋白理論分子量為 67.35 KDa，等電點(diǎn)為 8.64；NrIme2 基因編碼 773 個(gè)氨基酸，蛋白理論分子量為 85.06 KDa，等電點(diǎn)為 9.55。② 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用 SignalP 在線蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)網(wǎng)站，獲得 NrRim15,NrUme6 與 NrIme2 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖譜，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因所編碼的蛋白均無信號(hào)肽，同時(shí)說明三個(gè)蛋白均不屬于分泌蛋白（圖 3.1）。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S476

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2711786