【摘要】：在本實驗以臭豆腐、辣醬、湯子面等發(fā)酵食品為原料篩選乳酸菌,并通過牛津杯擴(kuò)散法篩選出7株對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌具有抑菌效果的乳酸菌。經(jīng)16s rRNA鑒定初篩出的7株抑菌菌株分別屬于植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和副干酪乳桿菌。經(jīng)蛋白酶K,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解實驗和硫酸銨沉淀實驗初步表明7株乳酸菌中抑菌成分屬于蛋白類的抗菌肽。且濃縮后T8對于金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌效果則顯著增強(13 mm)。大部分菌株抗菌肽耐高溫、耐酸且可以溶于醇類物質(zhì)。而大部分菌株抗菌能力經(jīng)表面活性劑吐溫80處理后顯著下降,T4甚至完全失去了抑菌能力。在抑制細(xì)菌生長的實驗中,培養(yǎng)12 h的3×MRS組實驗組中致病菌的OD值和菌落數(shù)(10~155 CFU/mL)明顯高于單純致病菌組(10~100 CFU/mL)和3×S6(10~122 CFU/mL),整體而言上清液在起到抑制微生物生長的同時,可能因MRS中存在一定的促菌生長因素。由乳酸菌中提取抗菌肽成本高工藝復(fù)雜,而通過基因克隆技術(shù)則具有低成本和高產(chǎn)量的特點。所以通過基因篩選技術(shù)從篩選出具有抑菌效果的的7株樣本中獲得了PlnF、PlnE、PlnN、PlnJ、PlnK等抗菌肽基因。在pET28a/BL21(DE3)大腸桿菌表達(dá)載體,PlnF、E、K、J和N基因通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出兩端含有Nco I和Xho I酶切位點的片段,并與pET28a構(gòu)建重組質(zhì)粒。經(jīng)PCR和測序驗證構(gòu)建成功的pET28a-PlnF、E、K、J和N經(jīng)0.5 mM的IPTG誘導(dǎo)6 h后,離心破碎菌體收集包涵體,8 M對包涵體進(jìn)行變復(fù)性處理之后經(jīng)Ni柱純化透析復(fù)性后的蛋白經(jīng)牛津杯擴(kuò)散法發(fā)現(xiàn),分子量約為5.9 kDa的PlnF純化蛋白對金黃色葡萄球菌具有13.43±0.21 mm的抑菌圈。而抗菌肽在pET28a載體中表達(dá)后,即使經(jīng)變復(fù)性處理后大部分表達(dá)蛋白依舊活性不佳。所以在乳酸乳球菌pNZ8149/NZ3900表達(dá)載體中,通過Nco I、Sph I和Sph I、Sac I雙酶切構(gòu)建含有usp45信號肽的pNZ8149-usp-PlnF重組質(zhì)粒。電阻200?、10 KV/cm電場中將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入NZ3900中,溴甲酚紫篩選培養(yǎng)基、PCR驗證、測序等篩選陽性轉(zhuǎn)化子。Nisin誘導(dǎo)6 h后,上清液對金黃色葡萄球菌具有14.03±0.23 mm的抑菌圈。通過Tricin e-SDS-PAGE和nanoLC-ESI-MS/MS分析分子量約6 kDa的目的蛋白與抗菌肽PlnF蛋白相似度高達(dá)97.6%,結(jié)果證明PlnF抗菌肽基因在結(jié)合usp45信號肽基因下可以以胞外分泌的形式在NZ3900/pNZ8149表達(dá)載體中正確表達(dá),而且通過原核表達(dá)的形式可以有效提高抗菌肽的純度和提取量,對抗菌肽的應(yīng)用具有一定的促進(jìn)作用。
【圖文】：

UV1800紫 外分紫紫度計日本青津GL-2 0G離 心機(jī)上海安上科學(xué)儀器北牛津杯 東超市吉七不東東制品直電垂垂，水平電垂垂，DYY-1 1型 電垂儀北北六一儀器北GeneAmp PCR System 9700 美國 ABI公司JY92- II型 超聲型細(xì)胞淀碎機(jī)寧型新寧生物科技寧寧有ECM399型 電轉(zhuǎn)化儀美國 BTX公司門氏菌腸亞種鼠傷寒血清型(ATCC 14028)、金黃色葡萄球菌金黃大腸埃希氏菌(ATCC 8739)和蠟樣芽胞桿菌(CICC 20551)均購于中國理中心（圖 1）。pET28a-DH5α 菌株購自淼靈生物；BL21（DE3北北全日金。149 菌株、NZ3900 菌株，以及分離篩選出的乳酸菌菌株均保藏于吉工程學(xué)院食品毒理與安全實驗室。

將新合成的引物按照 2.3.1 的反CR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖電垂后按照照愛思質(zhì)粒小題試劑凝進(jìn)行提取。組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 Xho I 酶切位點的抗菌肽 PCR 產(chǎn)物與 p添加 25 μL 的 PCR 產(chǎn)物/pET28a 質(zhì)粒，超純水補足構(gòu)建 50 μL 雙酶切反應(yīng)體系進(jìn)行電垂操作后進(jìn)行凝回收處理。pET28a 質(zhì)粒能更好的重組，在 10 μL 的連 Buffer，經(jīng)雙酶切的 pET28a 和 PCR 產(chǎn)將混勻的體系置于 16 ℃過夜反應(yīng)后，，粒轉(zhuǎn)化入宿主菌株內(nèi)。并涂布在含有 篩選出重組菌株。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TS201.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2704250