發(fā)布時間：2017-03-27 11:10

  本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌基因密碼鎖的設(shè)計，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著合成生物學(xué)快速發(fā)展,經(jīng)過遺傳改造的優(yōu)良微生物廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品、生物材料、化工和能源等領(lǐng)域,但同時也伴隨著緊迫的生物安全和生物技術(shù)產(chǎn)權(quán)糾紛問題,這些微生物一旦釋放到外界環(huán)境,會帶來難以預(yù)料的后果,如生態(tài)環(huán)境的破壞和技術(shù)創(chuàng)新的阻礙等。本文基于大腸桿菌的細胞分裂調(diào)控基因和必需基因,利用合成生物學(xué)、分子生物學(xué)等方法設(shè)計并構(gòu)建了兩種基因密碼鎖,以期達到人工控制細胞生長及保護微生物菌種的目的。主要研究結(jié)果如下:通過選擇大腸桿菌細胞分裂抑制基因minC、minC-minD和微生物群體感應(yīng)系統(tǒng)AHL-Lux R設(shè)計了2種細胞分裂調(diào)控基因線路,使細胞生長分別下降了53.34%和59.33%,有效地抑制了大腸桿菌的分裂和生長,并通過外源添加群體感應(yīng)分子�；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)調(diào)控minC和minC-minD的表達,探索了其對細胞生長的精細調(diào)控。通過選擇與大腸桿菌細胞呼吸相關(guān)的必需基因尿卟啉原III合成酶基因hemD及阿拉伯糖、IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)的伴侶蛋白ipgC和轉(zhuǎn)錄因子mxiE等基因元件設(shè)計了2種必需基因調(diào)控線路。一種是由阿拉伯糖直接誘導(dǎo)表達hemD的單層基因線路,另一種是由阿拉伯糖和IPTG共同誘導(dǎo)表達hemD的雙層“與”門基因線路。結(jié)果表明,敲除hemD的菌株ΔhemD生長緩慢,加入誘導(dǎo)劑后均可激活單層和雙層調(diào)控hemD表達的必需基因線路,可以有效調(diào)節(jié)微生物生長。本文所構(gòu)建的2種類型的基因密碼鎖均可控制大腸桿菌的生長和存活率,從而可避免危險生物因子的傳播和擴散,保護微生物改造的知識產(chǎn)權(quán),減少菌種流失的經(jīng)濟損失,在生物安全和保護領(lǐng)域具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：基因密碼鎖 細胞分裂 必需基因 細胞生長調(diào)控 生物安全
【學(xué)位授予單位】：北京理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q93
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 前言11-13
• 第1章 緒論13-25
• 1.1 微生物菌種安全與保護策略13-16
• 1.1.1 物理防護13-14
• 1.1.2 構(gòu)建毒素-抗毒素系統(tǒng)14
• 1.1.3 構(gòu)建缺陷型菌株14-15
• 1.1.4 構(gòu)建基因線路15-16
• 1.2 細胞生長的調(diào)控機制16-22
• 1.2.1 細胞分裂機制16-18
• 1.2.2 必需基因表達調(diào)控18-20
• 1.2.3 細胞程序化死亡20-22
• 1.2.4 外界環(huán)境的調(diào)控22
• 1.3 基因密碼鎖的應(yīng)用22-23
• 1.3.1 工業(yè)生產(chǎn)22
• 1.3.2 生物安全22-23
• 1.3.3 知識產(chǎn)權(quán)保護23
• 1.4 論文選題依據(jù)及研究內(nèi)容23-25
• 第2章 材料與方法25-39
• 2.1 材料25-28
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒25
• 2.1.2 培養(yǎng)基25
• 2.1.3 藥品和試劑25-27
• 2.1.4 儀器與設(shè)備27-28
• 2.2 方法28-39
• 2.2.1 菌體培養(yǎng)28-29
• 2.2.2 基因組DNA的提取29
• 2.2.3 質(zhì)粒提取29-30
• 2.2.4 PCR30-32
• 2.2.5 3A-Assembly及酶切體系與連接體系32-33
• 2.2.6 酶切產(chǎn)物與PCR產(chǎn)物回收33-34
• 2.2.7 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與熱激法轉(zhuǎn)化34-35
• 2.2.8 大腸桿菌電擊轉(zhuǎn)化35
• 2.2.9 菌落PCR篩選陽性克隆35-36
• 2.2.10 一步法定點突變36
• 2.2.11 標(biāo)準元件的構(gòu)建36-37
• 2.2.12 大腸桿菌恒定溫度培養(yǎng)37
• 2.2.13 涂布平板法活菌數(shù)的測定37
• 2.2.14 熒光顯微鏡檢測方法37
• 2.2.15 流式細胞儀熒光強度檢測方法37
• 2.2.16 丙酮酸激酶活性檢測方法37-38
• 2.2.17 蘋果酸脫氫酶活性檢測方法38-39
• 第3章 細胞分裂調(diào)控基因線路的設(shè)計與應(yīng)用39-51
• 引言39
• 3.1 細胞分裂調(diào)控基因的功能分析39-45
• 3.1.1 細胞分裂調(diào)控基因的克隆39-40
• 3.1.2 單基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建40-41
• 3.1.3 多基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建41-43
• 3.1.4 細胞分裂調(diào)控基因的功能驗證43-45
• 3.2 細胞分裂調(diào)控基因線路的組裝與驗證45-50
• 3.2.1 細胞分裂調(diào)控基因線路的設(shè)計45-46
• 3.2.2 細胞分裂調(diào)控基因線路的組裝與轉(zhuǎn)化46-47
• 3.2.3 細胞分裂調(diào)控基因線路的功能驗證47-50
• 3.3 小結(jié)50-51
• 第4章 必需基因調(diào)控線路的設(shè)計與應(yīng)用51-67
• 引言51
• 4.1 必需基因調(diào)控線路的設(shè)計51-55
• 4.1.1 必需基因hemD的克隆51-52
• 4.1.2 必需基因敲除菌株 ΔhemD的驗證52-54
• 4.1.3 必需基因調(diào)控線路的設(shè)計54-55
• 4.2 必需基因調(diào)控線路的組裝與驗證55-65
• 4.2.1 單層基因線路的構(gòu)建55-58
• 4.2.2 單層基因線路的驗證58-60
• 4.2.3 雙層“與”門基因線路的構(gòu)建60-63
• 4.2.4 雙層“與”門基因線路的驗證63-65
• 4.3 小結(jié)65-67
• 第5章 結(jié)論與展望67-69
• 5.1 結(jié)論67-68
• 5.2 展望68-69
• 參考文獻69-74
• 作者簡介74-75
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文與研究成果清單75-76
• 致謝76

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  本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌基因密碼鎖的設(shè)計，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：270313