【摘要】：本實(shí)驗(yàn)起始菌株為實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的菌株13#菌株,該菌株中的GOD基因是使用了 DNA shuffling技術(shù)改造后的,其中有三個(gè)氨基酸序列發(fā)生了突變(D195G,T357A,L368P)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中為提高菌株產(chǎn)酶的能力,分步進(jìn)行了幾個(gè)階段的探索研究:第一階段:在破胞后對(duì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行蛋白電泳發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)仍存在一部分目的蛋白未分泌出來(lái),在蛋白表達(dá)分泌的角度對(duì)目的菌株進(jìn)行了改造,分別在轉(zhuǎn)運(yùn),折疊,以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控對(duì)菌株進(jìn)行了改造。在pGAPZB載體上插入了轉(zhuǎn)運(yùn)因子SEC56,發(fā)酵結(jié)果顯示在表達(dá)了轉(zhuǎn)運(yùn)因子后目的蛋白的表達(dá)量未得到提高;在pGAPZB分別插入了 CNE1,BDP和PDI三個(gè)折疊修飾因子,其中BIP基因的表達(dá)使得目的蛋白的表達(dá)量得到了提高;在pGAPZB載體上插入了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HAC1和THR,發(fā)酵結(jié)果在表達(dá)了HAC1轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的菌株目的蛋白表達(dá)有提高。第二階段:對(duì)上罐發(fā)酵的鹽離子培養(yǎng)基的濃度進(jìn)行了簡(jiǎn)單的優(yōu)化,在BSM培養(yǎng)基離子濃度為0.5時(shí)顯示其菌體生長(zhǎng)最好,酶活由364 U/ml提升到了 446 U/ml。在表達(dá)了 BIP基因后的菌株的3L鹽離子培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵最終測(cè)定粗發(fā)酵液的酶蛋白活性為530 U/ml,從粗發(fā)酵液的酶的活力來(lái)看酶的產(chǎn)量提高了 18%;同樣進(jìn)行鹽離子培養(yǎng)基發(fā)酵的結(jié)果顯示表達(dá)了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HAC1的菌株最終發(fā)酵液酶活達(dá)到了 600 U/ml,酶的產(chǎn)量提升了 30%多;在之后的工作中對(duì)酶活最高的菌株HAC1進(jìn)行了進(jìn)一步的探究,在HAC1菌株中表達(dá)了來(lái)源于透明顫菌的血紅蛋白基因vgb,測(cè)定粗發(fā)酵液的活性結(jié)果酶蛋白的活性達(dá)到了 630 U/ml,該階段vgb蛋白的表達(dá)小弧度的提高了目的蛋白的表達(dá),而該階段菌體的生長(zhǎng)后期低于對(duì)照菌株。第三階段:對(duì)不同來(lái)源的基因的表達(dá)進(jìn)行了對(duì)比,將突變后的黑曲霉來(lái)源的GOD和尼奇青霉來(lái)源的GOX進(jìn)行密碼子優(yōu)化后進(jìn)行了表達(dá)。發(fā)酵數(shù)據(jù)顯示同一基因來(lái)源的基因GOD,密碼子偏好性優(yōu)化之后進(jìn)行的表達(dá)的菌株酶蛋白活性為540 U/ml,未進(jìn)行密碼子偏好性優(yōu)化過(guò)進(jìn)行的表達(dá)的菌株的酶蛋白活性為446 U/ml;不同來(lái)源的基因優(yōu)化過(guò)在同一表達(dá)體系中的表達(dá)量也純?cè)诓町?GOX的在菌株中最后的表達(dá)酶蛋白活性為640 U/ml,而GOD的酶蛋白活性為540 U/ml。經(jīng)鎳柱純化后經(jīng)過(guò)超微量分光光度計(jì)和蛋白電泳的驗(yàn)證,結(jié)果顯示GOX來(lái)源的基因在最終蛋白表達(dá)量為1.32 g/L,GOD的量有1.17 g/L低于GOX的表達(dá)量。
【圖文】：

Ｍｅｔｈａｎｏｆ邋ｑｓ邐ｍＲＮＡ邋ＡＯＸ１逡逑圖１－２不同ＲＯＬ基因拷貝數(shù)對(duì)應(yīng)甲醇消耗的速率逡逑Ｆｉｇ，ｌ－２邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＲＯＬ邋ｇｅｎｅ邋ｃｏｐｙ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋ｍｅｔｈａｎｏｌ邋ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ逡逑值得注意的是，盡管ＲＯＬ的ｍＲＮＡ達(dá)到ＲＯＬ四拷貝以上的水平，但隨著拷貝逡逑數(shù)從４增加到１５，目的蛋白的表達(dá)水平降低，因此也指出了邋ＲＯＬ基因在該表達(dá)系統(tǒng)逡逑中的限制條件，圖１－１為Ｅｌｅｎａ邋ＣＡｍａｒａｙａｎ研宄中轉(zhuǎn)錄量酶活和拷貝數(shù)之間的關(guān)系。逡逑Ｓ０００邋＝邐ｒ邋２逡逑�！蓿尬荩颍�0逡逑ＯＣ邐１Ｃ邐２Ｃ邐４Ｃ邐８Ｃ邐１５Ｃ逡逑＿＿邋￡ｘｔｒａｃｅ８ｕｌａｒ邋Ｈｐａｓｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ＭＨＨ邋ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｉｐａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邐ｍＲＮＡ邋ＲＯＬ邋—？—ｍＲＮＡ邋ＲＯｔ邋ｎｏｒｍａｌｓｊｅｄ逡逑圖１－３不同ＲＯＬ基因拷貝數(shù)基因轉(zhuǎn)錄效率逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＲＯＬ邋ｇｅｎｅ邋ｃｏｐｙ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｇｅｎｅ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ逡逑而很多文章顯示不同的基因在畢赤酵母中的最佳拷貝數(shù)依然還不是很清楚，在不逡逑同的基因的表達(dá)中有高拷貝顯示出了高目的蛋白的表達(dá)，而很多高拷貝的基因則表現(xiàn)逡逑出了更低量的表達(dá)。逡逑當(dāng)基因的拷貝數(shù)超過(guò)某個(gè)閾值時(shí)基因劑量增加經(jīng)常導(dǎo)致生產(chǎn)力降低和對(duì)細(xì)胞生逡逑長(zhǎng)的嚴(yán)重負(fù)面影響

２．邋２構(gòu)建強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)因子工程菌逡逑實(shí)驗(yàn)的出發(fā)點(diǎn)：蛋白的表達(dá)過(guò)程需要經(jīng)歷在表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄，，翻譯，折疊修飾，逡逑轉(zhuǎn)運(yùn)最后被分泌到細(xì)胞外，圖２－１為外源分泌蛋白的分泌路徑。逡逑泡融入逡逑Ａ邋芽泡邐＾邐質(zhì)膜逡逑0邋0逡逑心Ｊ■核焌邐ＶＪ＇Ｊ邐分泌出胞外逡逑高爾基體邐

本文編號(hào)：2701846