發(fā)布時(shí)間：2020-06-07 04:41

【摘要】：熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)2P24分離自小麥全蝕病自然衰退土壤,對(duì)多種植物土傳病害具有良好的防效,產(chǎn)生抗生素2,4-二乙�；g苯三酚(2,4-diacetylphlorlucinol,2,4-DAPG)是其主要的生防機(jī)制。本研究利用Tn5轉(zhuǎn)座子篩選到oprF和sigX基因影響抗生素產(chǎn)量并對(duì)oprF和sigX調(diào)控2,4-DAPG產(chǎn)量的機(jī)制進(jìn)行探索。利用菌株產(chǎn)生紅色色素的性狀作為篩選靶標(biāo),從大約10000個(gè)轉(zhuǎn)座突變體中初篩獲得8個(gè)抗生素產(chǎn)量提高的突變體,編號(hào)分別為PM640-PM710,測(cè)序表明轉(zhuǎn)座子分別插入到phlF、oprF、ass、nirF、waaQ、vacB、oprL和emhA基因上,其中oprF突變體產(chǎn)量提高最顯著。oprF基因編碼一個(gè)跨膜通道蛋白,卜游是ECF(extracytoplasmic functions)類σ因子基因sigX。利用同源雙重組法構(gòu)建oprF內(nèi)缺失突變體PM651、sigX內(nèi)缺失突變體PM652以及雙突變體PM653,抗生素產(chǎn)量分析表明PM651(ΔoprF)的2,4-DAPG和中間產(chǎn)物間苯二酚(PG,phloroglucinol)產(chǎn)量提高,而 PM652(ΔsigX)的 2,4-DAPG 和 PG 產(chǎn)量下降。雙突變體 PM653(ΔprFΔsigX)與 PM652(ΔsigX)表型趨勢(shì)一致,而且雙突變體中互補(bǔ)SigX后抗生素表型向野生型恢復(fù),但互補(bǔ)OprF基因表型沒(méi)有恢復(fù)。對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中各菌株對(duì)立枯絲核菌的抑菌效果也與抗生素產(chǎn)量的結(jié)果一致。以上結(jié)果表明oprF負(fù)調(diào)控抗生素產(chǎn)量,sigX正調(diào)控抗生素產(chǎn)量,并且oprF對(duì)抗生素產(chǎn)量的調(diào)控依賴sigX基因。溫室防病試驗(yàn)結(jié)果表明突變體PM651(ΔoprF)和PM652(ΔsigX)防治番茄青枯病能力和根圍定殖能力均較野生型顯著下降。此外,oprF基因負(fù)調(diào)控菌株AHL信號(hào)的產(chǎn)生,而sigX基因正調(diào)控信號(hào)產(chǎn)量;oprF和sigX基因均正調(diào)控菌株2P24的游動(dòng)能力和生物膜的形成。多個(gè)生防相關(guān)性狀都受到oprF和sigX基因影響,表明這兩個(gè)基岡與菌株的環(huán)境適應(yīng)性關(guān)系密切。菌株2P24中,在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上均證明sigX正調(diào)控oprF基因表達(dá),oprF基因負(fù)反饋調(diào)節(jié)sigX的表達(dá)。但oprF和sigX突變體中PhlA和PhlD的蛋白表達(dá)水平較野生型沒(méi)有顯著變化。由于突變體中PG產(chǎn)量發(fā)生改變但PhlD水平?jīng)]有發(fā)生變化,推測(cè)是PG的底物量發(fā)生了變化。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)sigX突變體PM652中丙二酸單酰輔酶A(malonyl-CoA)水平顯著下降,說(shuō)明sigX正調(diào)控malonyl-CoA產(chǎn)量。進(jìn)一步對(duì)乙酰輔酶A羧化酶四個(gè)亞基(AccA、AccB、AccC、AccD)的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平檢測(cè),accA和aaccC的表達(dá)在oprF突變體中顯著提高,而在sigX突變體中顯著下降。以上研究表明oprF和sigX基因是一類新發(fā)現(xiàn)的,通過(guò)影響菌株2,4-DAPG的底物供給來(lái)改變抗生素的產(chǎn)量。利用表型芯片組(Phenotype Microarray,Biolog,America)系統(tǒng)篩選能夠誘導(dǎo)sigX表達(dá)的條件,證明低滲透勢(shì)條件、甘氨酸以及某些抗生素能有效促進(jìn)sigX的表達(dá)。驗(yàn)證試驗(yàn)也證明野生型2P24在低鹽和高甘氨酸條件下PG產(chǎn)量提高,而sigX突變體沒(méi)有顯著變化。SigX可以感知環(huán)境壓力對(duì)細(xì)胞外膜造成的脅迫,調(diào)節(jié)抗生素2,4-DAPG的合成,對(duì)于抵御其他微生物侵害,快速修復(fù)細(xì)胞損傷,以及適應(yīng)不良環(huán)境都有重要意義。
【圖文】：

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文邐第－？章緒ｉ（逡逑Ｉ－Ｖ生物型（／�。罚鳎铮颍澹悖澹睿螅猓椋铮觯幔蝈澹桑郑╁澹ǎ樱簦幔睿澹颍澹簦幔欤�，１９９６）。這種方法對(duì)突光類假單胞菌的區(qū)逡逑分更加細(xì)致，但缺點(diǎn)是（、能將月和Ｐ．／ＺｗｏｒｅｓｃＣＴＭ■的這兩個(gè)相似性較高的種很好的區(qū)分。逡逑進(jìn)步對(duì)上述分類方法進(jìn)行完善和補(bǔ)充，從更多表型、生理、形態(tài)、生化等多方而因素考量，逡逑并對(duì)其進(jìn)行賦值后利用公式進(jìn)行數(shù)學(xué)運(yùn)算，從而利用數(shù)值分類法的進(jìn)行分類。例如常用的Ｂｉｏｌｏｇ逡逑ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ邋ｓｙｓｔｅｍ邋（Ｂｉｏｌｏｇ邋Ｈａｙｗａｒｄ，邋ＵＳＡ）就屬于這種分類系統(tǒng)。利用這類系統(tǒng)可以將之前的生逡逑物型進(jìn)步劃分為不同的亞組（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）。檢測(cè)表明熒光假單胞菌的Ｉ、ＩＩ、ＴＩＩ生物型亞組的相逡逑似度較高，而ＩＶ與其他幾個(gè)生物型亞組差異較大，因此研究人員更傾向于將ＩＶ亞組劃分成為種逡逑（Ｊａｎｓｅｅｔａｌ．，，邋１９９２）。但對(duì)于區(qū)分和？Ｐ．／Ｚｗｏｒａｓ＇ｃｅ似菌株，該方法還是難以奏效。逡逑在利用表型分類技術(shù)不斷發(fā)展的同時(shí)，分子生物學(xué)的分類手段也對(duì)假單胞菌的分類起到了重逡逑要的推動(dòng)作用。利用ＤＮＡ－ＲＮＡ雜交方法可將假單胞菌劃分為５個(gè)核糖體同源組，其中己知的熒光逡逑假單胞菌株大多屬于核糖體同源組Ｉ邋（Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ，１９７４）。通過(guò)對(duì)大量菌株進(jìn)行ＤＮＡ和ＤＮＡ的雜逡逑交表明，不同菌株之間差異較明顯。戶押似ａ和戶．／Ｚｗｏｒｅｓｃｅｍ’基因組ＤＮＡ雜交的一致性不超過(guò)５５％，逡逑表明這兩個(gè)種在核酸水平差異明顯，可以通過(guò)ＤＮＡ雜交對(duì)這兩個(gè)種的菌株進(jìn)行區(qū)分（Ｌａｇｕｅｒｒｅｅｔ逡逑ａｌ．，１９９４），但該方法花費(fèi)昂貴且耗時(shí)，在一般的種類鑒定中并不常用。逡逑／

四個(gè)基因負(fù)責(zé)２，４－ＤＡＰＧ的合成。對(duì)沖／雙’ＳＺ）的基因丨＞ｉｊ隔區(qū)分析衣明，Ｈ有／ＡＭ基因逡逑上游有啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)子截?cái)鄬?shí)驗(yàn)Ｈｉ證明由同個(gè)動(dòng)子擰制轉(zhuǎn)錄，所以是逡逑作為？個(gè)轉(zhuǎn)？＾申．兀進(jìn)行轉(zhuǎn)４友達(dá)的（ＢａｎｇｅｒａａｎｄＴｈｏｍａｓｈｏｗ，邋１９９９）0逡逑ＰｈｌＤ蛋白作為ＩＩＩ型聚酮合酶（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅｓ，邋ＰＫＳｓ）家族中的一貨，其氨基酸序列在逡逑２，４－ＤＡＰＧ產(chǎn)生菌中極為保守，ＰｈｌＤｌｉｉＭ２，４－ＤＡＰＧ合成途抒中的限速酶（Ｐｉｃａｒｄａｎｄ邋Ｂｏｓｃｏ，２００３）。逡逑對(duì)ＰｈｌＤ的功能解析表明，ＰｈｌＤ有底物專一性，只有丙二酰單酸輔酶Ａ邋（ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ）作為底物時(shí)，逡逑ＰｈｌＤ才表現(xiàn)酰雄轉(zhuǎn)移酶活性（Ａｃｈｋａｒｅｔａｌ．，２００５）。在ＰｈｌＤ的催化卜＿３分子的ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ通過(guò)聚逡逑酮縮合過(guò)程產(chǎn)生３，５－庚—酮乙醋（３，５－出１如0１＾１３１＾（１丨（＾），進(jìn)而環(huán)化脫竣形成間苯二盼（六￡；１１１（３＾逡逑ａｌ．，邋２００５）。如圖１－４所示２，４－ＤＡＰＧ的合成途徑中，ＰＧ作為２，４－ＤＡＰＧ的直接前體，其合成過(guò)積和逡逑產(chǎn)雖直接影響了抗生素２，４－ＤＡＰＧ的最終產(chǎn)量。逡逑ＰｈｌＡ、ＰｈｌＢ、ＰｈＩＣ蛋白均具Q圂；潑富钚越峁褂潁詼鯢堪椎墓餐饔貌罰來(lái)臥詡溴義媳餃穎交返牧礁雋諼灰陰；�，产生中间产物单谊�；潯餃櫻ǎ恚錚睿錚幔悖澹簦歟穡瑁歟錚潁錚紓歟酰悖椋睿錚歟義希停粒校牽┖橢詹錚�，４＇礻帲灝�(dāng)椒櫻ǎ�，４－ＤＡＰ咯。对２，４－ＤＡＰq暮銑衫此擔(dān)饈瑁�？５二赣z咤義先保�？舱d澹擼�。Ｐｈe鈴宓柏�？由Ｓ邋Ｗ邋编職枘一个堝ＩＩ劐胡酮胎酰Ａ＞掑＠C搴銑贍穡ǎ

本文編號(hào)：2700861