【摘要】：小麥(Tritieum aestivum L.)是重要的世界性糧食作物,在保障全球糧食安全中占有重要地位。同時,世界范圍內(nèi)的土壤鹽漬化危害程度正在不斷加劇,由此引發(fā)的小麥產(chǎn)量和品質(zhì)下降等問題日益突出。因此,利用生物工程技術(shù)將耐鹽基因?qū)胄←溡蕴岣咂淠望}性具有廣闊的應(yīng)用前景,而穩(wěn)定、高效的小麥再生體系是實現(xiàn)基因工程操作的必要條件。鹽生植物鹽生草(Halogeton glomeratus)主要分布于我國西北旱區(qū)和半干旱地區(qū),具有極強的耐鹽抗旱性,是發(fā)掘耐鹽基因的優(yōu)質(zhì)物種。本研究以小麥永春2460成熟胚為外植體,構(gòu)建了穩(wěn)定高效的小麥再生體系,同時利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,并將鹽生草中克隆出的耐鹽候選基因在擬南芥中進(jìn)行功能驗證,主要結(jié)果如下:(1)永春2460小麥成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的外植體最佳處理方法為將種子用30%NaCl O滅菌20 min,用無菌水沖洗干凈后浸泡12 h,將小麥胚完整剝下后用刀片破壞胚芽生長點,再用十字切法將胚切成四份后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基,其愈傷誘導(dǎo)率較高,并能有效防止胚直接發(fā)育成幼苗。(2)選用不同激素配比處理對小麥愈傷組織生長體系進(jìn)行優(yōu)化,最終確定了較為適宜的愈傷誘導(dǎo)和分化激素配比:2.5 mg/L的2,4-D有利于愈傷組織的誘導(dǎo),培養(yǎng)體系為MS基本培養(yǎng)基+CH(0.5 g/L)+Pro(0.5 g/L)+2,4-D(2.5 mg/L)+蔗糖(15 g/L)+麥芽糖(15 g/L)+瓊脂(4 g/L),pH值為5.6~6.0;愈傷分化體系為MS基本培養(yǎng)基+KT(3.0 mg/L)+6-BA(2.0 mg/L)+蔗糖(15 g/L)+麥芽糖(15 g/L)+瓊脂(4 g/L),pH值為5.6~6.0。(3)確定了適用于小麥愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化條件:菌液濃度OD_(600)=0.6,愈傷侵染情況較好且存活率相對較高;頭孢霉素濃度為600 mg/L時農(nóng)桿菌抑菌效果較好,還發(fā)現(xiàn)侵染過程中使用超聲波處理和加入乙酰丁香酮對于提高其遺傳轉(zhuǎn)化效率具有一定的輔助作用。(4)以轉(zhuǎn)化鹽生草CL5527基因的擬南芥T_2代為材料,研究該基因?qū)M南芥耐鹽性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CL5527基因能明顯提高擬南芥的綠芽率,當(dāng)NaCl脅迫濃度為30 mmol/L和120 mmol/L時,CL5527轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系的耐鹽性差異較小,在60~90 mmol/L NaCl脅迫時差異顯著(P0.05)。根系生長方面:隨著NaCl脅迫濃度的增加,野生型和轉(zhuǎn)基因株系的主根生長受到抑制,根長逐漸下降,其中野生型株系主根長度下降幅度較大,轉(zhuǎn)基因株系則相對穩(wěn)定,二者差異顯著(P0.05);同時鹽脅迫下擬南芥的側(cè)根數(shù)目不斷增加,野生型和轉(zhuǎn)基因株系之間差異不顯著;表型特征方面:鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系較野生型表現(xiàn)出明顯的耐鹽優(yōu)勢,在不同NaCl濃度脅迫下轉(zhuǎn)基因株系生長狀況均好于野生型;生理生化指標(biāo)方面:在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系比野生型的葉片葉綠素含量下降幅度要小,其光合系統(tǒng)破環(huán)較輕,對MDA含量及相對電導(dǎo)率等分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的脂膜受損程度較野生型輕。CL5527基因的表達(dá)在一定程度上能夠提高擬南芥的耐鹽性。
【圖文】：

2 個不同基因型小麥在不同的激素配比培養(yǎng)基中表現(xiàn)出一定差異，其中 KT 濃度為 3.0mg/L、6-BA 濃度為 2.0 mg/L 時的分化率最高，在相同的培養(yǎng)條件下，永春 2460 誘導(dǎo)的愈傷組織綠點出現(xiàn)時間要比中麥 175 愈傷綠點時間早2~3 天，并且綠點成苗率相對較高。愈傷誘導(dǎo) 愈傷繼代 愈傷分化 愈傷成苗

對愈傷生長的影響代生長狀態(tài)較好的永春 2460 成熟胚誘導(dǎo)的組織切成兩半，作為農(nóng)桿菌侵染材料。菌液2、OD600=0.4、OD600=0.6、OD600=0.8、OD6組織隨著農(nóng)桿菌侵染液濃度的增大，，褐化為 OD600=0.2、OD600=0.4 時，農(nóng)桿菌侵染效 0.2 時成活率為 82%，OD600值為 0.4 時存00=0.6 時，侵染效果較好，愈傷成活率為 5OD600=1.0 時，愈傷受損嚴(yán)重，成活率顯著圖 3-2 農(nóng)桿菌菌液 PCR 檢測Fig3-2. The PCR detection of Agrobacterium tuM: Marker; 1-6:菌液 PCR 產(chǎn)物M: Marker; 1-6: the product of Colony P
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S512.1;Q943.2

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本文編號：2699896