【摘要】：由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病被認(rèn)為是最具破壞性的植物病害之一。致病疫霉可以侵染馬鈴薯的葉、莖和薯塊,迅速摧毀植物,甚至可以在幾小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致植物死亡,嚴(yán)重危害馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。疫霉菌的有性生殖對(duì)其物種的演化和延續(xù)起著重要作用。疫霉菌的有性生殖是由性激素調(diào)控的。A1、A2交配型菌株分別產(chǎn)生α1和α2性激素,當(dāng)A1和A2交配型菌株共同配對(duì)培養(yǎng)時(shí),它們產(chǎn)生的α1和α2性激素分別誘導(dǎo)對(duì)方分化出雌、雄配子體,從而完成有性生殖,產(chǎn)生卵孢子。盡管目前α1和α2性激素已經(jīng)被分離鑒定,然而,關(guān)于疫霉菌有性生殖的機(jī)理仍未被揭示。本研究以致病疫霉為研究材料,建立了致病疫霉菌株的長(zhǎng)期保存方法,繪制了不同菌株的生長(zhǎng)曲線以確定其最佳培養(yǎng)時(shí)間,并通過(guò)不同方法檢測(cè)了致病疫霉菌株的交配型;克隆了A1交配型菌株HQK8-3 Pi GK5 c DNA蛋白編碼區(qū),并進(jìn)行了序列分析,通過(guò)熒光蛋白融合表達(dá)技術(shù)對(duì)Pi GK5蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位,通過(guò)RNA干擾技術(shù)對(duì)Pi GK5在致病疫霉無(wú)性生殖、有性生殖、致病性等方面的功能進(jìn)行了研究;通過(guò)i TRAQ技術(shù)研究α1性激素誘導(dǎo)下致病疫霉A2交配型菌株在不同時(shí)間點(diǎn)的差異磷酸化蛋白表達(dá)譜,并對(duì)差異蛋白表達(dá)譜進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析,篩選出一批潛在地可能與致病疫霉有性生殖密切相關(guān)的蛋白。結(jié)果表明,本研究中所使用的四種保存方法均能高度保持被測(cè)致病疫霉菌株的生存能力,且對(duì)菌株的生長(zhǎng)和形態(tài)特征沒(méi)有顯著影響,但四種保存方法對(duì)菌株致病性的影響具有菌株特異性。致病疫霉菌株HQK8-3的最佳培養(yǎng)時(shí)間為12天,YF3的為13天,2PO-D的為11天,2PO82001的為9天,USA1的為18天,P7723的為7天。菌株HQK8-3、2PO-D、USA1為A1交配型菌株,菌株2PO82001、P7723為A2交配型菌株,菌株YF3為A1自育型菌株。這些工作為接下來(lái)的研究奠定了基礎(chǔ)。致病疫霉A1交配型菌株HQK8-3的Pi GK5 c DNA蛋白編碼區(qū)序列全長(zhǎng)2763bp,編碼920個(gè)氨基酸,與NCBI公布的c DNA序列相似性為99.07%,氨基酸序列相似性為93.42%,菌株HQK8-3的Pi GK5的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與NCBI公布的Pi GK5的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致,說(shuō)明其功能也一致。A1交配型菌株HQK8-3中,Pi GK5在游動(dòng)孢子中相對(duì)表達(dá)量最高,其次在休止孢,在營(yíng)養(yǎng)菌絲、孢子囊和萌發(fā)的孢囊中表達(dá)量均相對(duì)較少。Pi GK5定位于原生質(zhì)體膜上及細(xì)胞內(nèi)的一些囊泡狀結(jié)構(gòu)中。Pi GK5基因參與了A1交配型致病疫霉游動(dòng)孢子的形成和卵孢子的形成,因此是一個(gè)對(duì)致病疫霉無(wú)性生殖和有性生殖均非常重要的基因,Pi GK5可能是α2性激素的受體。Pi GK5基因參與了A1交配型致病疫霉的致病性,可能是致病疫霉的重要致病因子。通過(guò)對(duì)α1性激素誘導(dǎo)致病疫霉A2交配型菌株的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析,共得到磷酸化的肽段6355個(gè),鑒定到的蛋白質(zhì)2508個(gè)。One way anova分析顯示,在α1性激素組篩選到453個(gè)差異磷酸化蛋白質(zhì),與對(duì)照相比,只在α1性激素組存在的差異磷酸化蛋白有249個(gè)。經(jīng)過(guò)在level2水平的GO功能注釋及KEGG通路分析,篩選到8個(gè)具有顯著差異的磷酸化蛋白,包括PITG_01203T0、PITG_06415T0、PITG_07286T0、PITG_07289T0、PITG_10062T0、PITG_19213T0、PITG_19890T0和PITG_22434T0。T Test分析顯示,α1性激素處理A2交配型致病疫霉1h、3h、8h、24h,分別篩選到185、43、189、43個(gè)差異蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)level2水平的GO功能注釋及KEGG通路分析,篩選到10個(gè)具有顯著差異的磷酸化蛋白,包括PITG_00397T0、PITG_00845T0、PITG_01947T0、PITG_04443T0、PITG_04663T0、PITG_07567T0、PITG_10083T0、PITG_12100T0、PITG_16183T0和PITG_17706T0。這18個(gè)蛋白極有可能參與致病疫霉有性生殖過(guò)程,其功能需要在今后的工作中進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究首次對(duì)致病疫霉Pi GK5基因在無(wú)性生殖、有性生殖及致病性中的作用進(jìn)行了研究,并通過(guò)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了α1性激素誘導(dǎo)下致病疫霉A2交配型菌株的差異磷酸化蛋白質(zhì)表達(dá)譜,篩選出一批與致病疫霉有性生殖密切相關(guān)的蛋白,該工作的完成對(duì)未來(lái)疫霉菌有性生殖分子機(jī)理的揭示及馬鈴薯晚疫病等植物疫病的有效防治具有比較重要的意義。
【圖文】：

圖 1 馬鈴薯晚疫病癥狀Fig.1 SymptomsofPotatoLateBlightA：馬鈴薯植株感染晚疫病菌的癥狀；B：鈴薯葉片感染晚疫病菌的癥狀圖；C 和D：馬鈴薯塊莖感染的癥狀。.2 馬鈴薯晚疫病的防治目前主要通過(guò)使用苯基酰胺類殺菌劑來(lái)防治馬鈴薯晚疫病，，這其中，甲Metalaxyl）是最有效的防治藥劑之一。1981 年[40-42,74]，在荷蘭和愛(ài)爾蘭首次馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈表現(xiàn)出抗藥性。隨后在歐洲、亞洲、南美洲及北美出現(xiàn)了抗性菌株的報(bào)道。1986-1988 年英國(guó)的抗性菌株群體由 41%上升至 60%92-1993年[44,74]在美國(guó)的15個(gè)州中發(fā)現(xiàn)有13個(gè)州出現(xiàn)了馬鈴薯晚疫病菌的抗況，1995 年蘇格蘭有 40%的馬鈴薯晚疫病菌呈現(xiàn)抗藥性[45,74]，而在 1998-2000西則有38%的抗性菌株出現(xiàn)[46,74]。

1.3.2 致病疫霉的無(wú)性生殖致病疫霉的無(wú)性生殖是造成其毀滅性流行的主要原因。致病疫霉可以產(chǎn)生孢子囊（圖2C），孢子囊可以直接萌發(fā)產(chǎn)生胚芽管或間接產(chǎn)生游動(dòng)孢子（圖 2D）。游
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.32

【參考文獻(xiàn)】

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1 姚東璧;李復(fù)煌;謝三磊;李桂萍;徐福州;房慧伶;孫惠玲;;副雞禽桿菌3個(gè)血清型參考菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和比較[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年07期

2 李麗s

本文編號(hào)：2693614