【摘要】：細菌素(Bacteriocin)是由不同種類的細菌通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白質(zhì)。許多乳酸菌產(chǎn)生的細菌素有非常廣泛的抑菌譜,在食品保藏中有很好的應用前景。將細菌素應用在食品工業(yè)中可以減少化學防腐劑的添加,減少熱處理強度,更自然的保存食物并且豐富其感官和營養(yǎng)特性。本研究中分離得到一株產(chǎn)細菌素且活性強的植物乳桿菌HD-23,優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基;將原核表達得到的細菌素PlnEF用于抑制鼠傷寒沙門氏菌SL1344,研究其基本的抑菌機理;探究PlnEF在鼠傷寒沙門氏菌SL1344細胞膜上可能的細菌素受體,主要結(jié)果如下:1產(chǎn)細菌素乳酸菌的分離鑒定從各地采集的自制泡菜水、豆豉、自釀酸奶、腐乳、臘魚中分離出80株在MRS平板上有明顯透明溶鈣圈的疑似乳酸菌。復篩采用抑菌試驗,對抑菌物質(zhì)進行生物學特性鑒定后篩選出一株產(chǎn)細菌素活性最強的菌株,分子生物學鑒定后命名為植物乳桿菌HD-23。2響應面優(yōu)化玉米粉培養(yǎng)基成分玉米作為我國糧食發(fā)展的支撐性作物,將其作為培養(yǎng)基成分是對糧食資源的合理利用,并且能降低細菌素生產(chǎn)成本,適應工業(yè)上低成本高產(chǎn)量的需求。對玉米粉培養(yǎng)基成分進行響應面優(yōu)化,抑菌試驗以抑菌圈直徑為響應值,得到最優(yōu)的培養(yǎng)基成分為8 g/l玉米粉、3.13 g/l葡萄糖、1.22 g/l蛋白胨、0.57g/l乙酸鈉、10 g/l牛肉膏、1 g/l酵母粉、2 g/l檸檬酸氫二銨、0.4 g/l碳酸氫二鉀、0.58g/l硫酸鎂、0.25 g/l硫酸錳、1 ml/l吐溫-80。3細菌素基因plnE和pln F的原核表達及純化使用同源重組酶的方法誘導載體質(zhì)粒pET-32a與目的擴增產(chǎn)物重組,重組質(zhì)粒經(jīng)兩次轉(zhuǎn)化后構(gòu)建pET-32a-plnE-E.coli BL21和pET-32a-plnF-E.coli BL21表達菌株。經(jīng)Ni-NTA親和層析柱,超濾以及腸激酶酶切后獲得純的PlnE肽(3.6 kDa)和PlnF肽(3.7 kDa)。抑菌譜測定顯示細菌素PlnEF對革蘭氏陽性、陰性菌均有抑菌作用。4細菌素PlnEF作用鼠傷寒沙門氏菌SL1344抑菌機理以純化后的細菌素PlnEF作用于鼠傷寒沙門氏菌SL1344,測得其細胞裂解率隨PlnEF添加量的增加而增加。正常情況下,胞外各物質(zhì)含量很少,經(jīng)細菌素處理后發(fā)現(xiàn)胞外ATP、乳酸脫氫酶、紫外吸收物質(zhì)都有明顯的增加。結(jié)果表明細菌素PlnEF通過使鼠傷寒沙門氏菌SL1344胞內(nèi)物質(zhì)泄露,從而導致細胞死亡。5細菌素PlnEF對鼠傷寒沙門氏菌SL1344作用結(jié)合位點的研究使用細菌素PlnEF處理鼠傷寒沙門氏菌SL1344,同時提取細菌素處理和未處理的的細胞膜蛋白進行雙向電泳,譜圖分析電泳圖上缺失的蛋白斑點,通過MALDI-TOF-MS測得可能產(chǎn)生影響的蛋白為磷酸甘油酸激酶(PGK)蛋白。用λ-red技術(shù)對PGK基因完整的開放閱讀框進行敲除,驗證細菌素PlnEF可能通過該蛋白對鼠傷寒沙門氏菌SL1344造成影響,使細胞死亡。本論文篩選出一株產(chǎn)細菌素活性較好的植物乳桿菌HD-23,將玉米粉添加至MRS培養(yǎng)基成分中發(fā)酵HD-23產(chǎn)細菌素,合理利用糧食資源,符合工業(yè)化生產(chǎn)需要。將細菌素基因plnEF同源重組到工程菌中,獲得純的細菌素PlnEF。鼠傷寒沙門氏菌SL1344為全基因組測序菌株,將其作為目標菌,有效的研究了細菌素PlnEF對該菌的抑菌機理是導致胞內(nèi)物質(zhì)泄露,從而使細胞死亡。本試驗中還探究了PlnEF在鼠傷寒沙門氏菌SL1344細胞膜受影響的為磷酸甘油酸激酶蛋白,并采用基因敲除的方法進行驗證。本研究中針對純細菌素PlnEF的試驗為二肽細菌素的深入研究提供了一定的基礎(chǔ)。
【圖文】：

表 12 PGK 菌落 PCR 擴增體系Table 12 The colony PCR system of PGK反應體系 25.0 μLPGK-jd-f 1.0 μLPGK-jd-r 1.0 μL2 Taq PCR Master Mix 12.5 μLddH2O 10.5 μL與分析菌素乳酸菌的分離鑒定篩中不同發(fā)酵樣品中共篩選出 80 株疑似乳酸菌。在含有 CaCO3的 MR形態(tài)呈圓形，中等大小，凸起，微白色，濕潤，邊緣整齊，可見明鈣圈（見圖 3a）。挑菌進行革蘭氏染色，在顯微鏡油鏡（1000×）短桿狀（見圖 3b），為乳酸短桿菌典型形態(tài)。

(a) (b)發(fā)酵上清液抑菌試驗 (a) 大腸桿菌 ATCC 25922，(b) 金黃色葡萄球菌 acterial test of supernatant of lactic acid bacteria (a) E.coli ATCC 25922,ATCC 13565、排過氧化氫干擾-23 菌株發(fā)酵上清液中和至 pH 為 7，做抑菌試驗后發(fā)現(xiàn)中和酸白組幾乎相同（見圖 5a），圖中原始即為 HD-23 菌株未調(diào) pH 明排除酸的作用后仍有抑菌物質(zhì)的存在，對其進一步確定。清液中加入過氧化氫酶處理，該處理相當于排除過氧化氫干擾現(xiàn)試驗組抑菌圈大小與原始組（未處理的 HD-23 菌株發(fā)酵上 5b），說明其抑菌現(xiàn)象不是過氧化氫的作用。排酸、排過氧化果的物質(zhì)不是有機酸或過氧化氫，，對抑菌物質(zhì)進行蛋白酶敏感
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TS201.3

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