【摘要】：鎘(Cd)是世界上最嚴(yán)重、毒性最大的重金屬污染物之一,嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。提高植物的鎘脅迫耐性對(duì)保障糧食安全與產(chǎn)量具有重要的意義。提高植物的鎘脅迫耐性有很多種途徑,其中就包括改調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。擴(kuò)展蛋白是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞壁松弛,促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞壁蛋白,幾乎存在于植物所有的細(xì)胞、組織和器官中。已有研究證明,擴(kuò)展蛋白參與了多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及逆境適應(yīng)性響應(yīng)。擴(kuò)展蛋白由多個(gè)基因家族組成,包括EXPA、EXPB、EXLA和EXLB家族,其中,EXPA和EXPB是兩個(gè)最大、研究最多的家族。本實(shí)驗(yàn)室前期從小麥HF9703中克隆得了EXPA家族擴(kuò)展蛋白基因TaEXPA2。為研究該基因在植物調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫耐性中的功能,我們構(gòu)建組成型表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化模式植物煙草,得到了過(guò)表達(dá)TaEXPA2的轉(zhuǎn)基因煙草株系。本研究分析了TaEXPA2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)煙草的鎘脅迫耐性及其作用機(jī)理。其主要結(jié)論如下:(1)qRT-PCR分析了小麥擴(kuò)展蛋白基因TaEXPA2的表達(dá)對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)。結(jié)果表明,鎘脅迫下,該基因在小麥葉片中上調(diào)表達(dá),呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢(shì)。(2)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PCR篩選鑒定,獲得三個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。用不同濃度的CdCl_2對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行鎘脅迫處理,研究轉(zhuǎn)基因植株的鎘脅迫耐性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在鎘脅迫下,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)率較高,主根較長(zhǎng),生物量積累明顯增多;成苗期轉(zhuǎn)基因植株的光合速率及相關(guān)參數(shù)均有所改善。表明TaEXPA2的過(guò)量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鎘脅迫的耐受性。(3)接下來(lái)分析了過(guò)表達(dá)TaEXPA2基因提高轉(zhuǎn)基因植株鎘脅迫耐性的機(jī)制。在細(xì)胞水平上,電鏡分析發(fā)現(xiàn),鎘脅迫下,轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損情況小于野生型植株,具體表現(xiàn)為葉綠體、線粒體及細(xì)胞核的降解程度低于野生型,且質(zhì)壁分離現(xiàn)象少于野生型。在生理水平上,鎘脅迫下,TaEXPA2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞受損傷程度明顯小于野生型,MDA含量及相對(duì)電導(dǎo)率也低于野生型,說(shuō)明過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草的膜相對(duì)比較穩(wěn)定。通過(guò)與野生型比較,我們發(fā)現(xiàn)TaEXPA2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草抗氧化能力顯著優(yōu)于野生型煙草。在鎘脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草的過(guò)氧化氫含量及超氧陰離子產(chǎn)生速率低于野生型,而超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性顯著高于野生型。證明TaEXPA2提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化能力。(4)分析了煙草植株根和葉中的鎘離子含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),鎘脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草的根和葉中鎘離子含量均低于野生型。同時(shí),鎘脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草植株質(zhì)膜上H~+-ATP酶活性顯著高于野生型,這對(duì)于促進(jìn)鎘離子的排出,減少鎘離子的積累起著重要的作用。另外,轉(zhuǎn)基因植株液泡膜上V-ATPase和PPase活性也高于野生型,這有助于鎘離子進(jìn)入液泡,減少鎘離子在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的積累。進(jìn)一步檢測(cè)了10分鐘內(nèi)細(xì)胞中鎘離子的位移變化,發(fā)現(xiàn)鎘脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草鎘離子外流現(xiàn)象較為明顯。以上結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)該基因改善了轉(zhuǎn)基因煙草的鎘離子分布。(5)檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因煙草脅迫相關(guān)基因的表達(dá),這些基因包括質(zhì)膜H~+轉(zhuǎn)運(yùn)基因(NtSOS,NtHKT521和NtHKT586),ROS相關(guān)基因(NTPOD和NTSOD),脯氨酸相關(guān)基因(NtP5CS)和脅迫防御相關(guān)基因(NtERD10C和NtERD10D)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),鎘脅迫下這些基因在轉(zhuǎn)基因植株中均比野生型植株表達(dá)量高。(6)進(jìn)一步利用擬南芥同源基因突變體atexpa2研究了TaEXPA2同源基因突變對(duì)于鎘脅迫耐性的影響。用1mM的CdCl_2處理后,所有擬南芥植株的生長(zhǎng)均受抑制,但是在野生型中,這種受抑制程度小于突變體植株,而大于轉(zhuǎn)基因植株。這些結(jié)果表明,TaEXPA2同源基因與植株的鎘脅迫耐性密切相關(guān)。綜上所述,我們的研究表明,小麥擴(kuò)展蛋白基因TaEXPA2參與了植物對(duì)鎘脅迫耐性的調(diào)控,TaEXPA2過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鎘脅迫的耐性,TaEXPA2同源基因突變?cè)鰪?qiáng)了擬南芥對(duì)鎘脅迫的敏感性。TaEXPA2轉(zhuǎn)基因植株鎘脅迫耐性的增強(qiáng)可能與其抗氧化能力的提高和鎘的吸收/轉(zhuǎn)運(yùn)能力的提高有關(guān)。
【圖文】：

圖 1-1 擴(kuò)展蛋白的結(jié)構(gòu)（徐筱等，2010）Fig. 1-1 The structure of expansin (Xu et al., 2010)蛋白首先被鑒定出來(lái)，它們具有細(xì)胞壁松弛-Mason et al., 1992）。在蛋白結(jié)構(gòu)上，該家族擴(kuò)構(gòu)和生化特征的原型，這對(duì)于現(xiàn)代生化分子結(jié)

圖 1-2 擴(kuò)展蛋白不同亞家族結(jié)構(gòu)域的比較（Choi et al., 2006）2 Comparison of different subfamily domains of expansin（Choi et al., 2006展蛋白是在研究 EXPA 和草類花粉過(guò)敏原 group-Ⅰ間敏原 group-Ⅰ歸類為 EXPB 家族（Cosgrove et al., 199軸的細(xì)胞壁幾乎沒有伸展能力，主要是在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2;S512.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 高英;擴(kuò)張蛋白與旱稻抗旱性關(guān)系的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

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本文編號(hào)：2664272