【摘要】：鎘(Cd)是世界上最嚴重、毒性最大的重金屬污染物之一,嚴重影響植物的生長發(fā)育。提高植物的鎘脅迫耐性對保障糧食安全與產(chǎn)量具有重要的意義。提高植物的鎘脅迫耐性有很多種途徑,其中就包括改調(diào)控相關基因的表達。擴展蛋白是一種調(diào)節(jié)細胞壁松弛,促進細胞伸長生長的細胞壁蛋白,幾乎存在于植物所有的細胞、組織和器官中。已有研究證明,擴展蛋白參與了多種植物的生長發(fā)育過程及逆境適應性響應。擴展蛋白由多個基因家族組成,包括EXPA、EXPB、EXLA和EXLB家族,其中,EXPA和EXPB是兩個最大、研究最多的家族。本實驗室前期從小麥HF9703中克隆得了EXPA家族擴展蛋白基因TaEXPA2。為研究該基因在植物調(diào)控生長發(fā)育及非生物脅迫耐性中的功能,我們構(gòu)建組成型表達載體,轉(zhuǎn)化模式植物煙草,得到了過表達TaEXPA2的轉(zhuǎn)基因煙草株系。本研究分析了TaEXPA2過表達轉(zhuǎn)煙草的鎘脅迫耐性及其作用機理。其主要結(jié)論如下:(1)qRT-PCR分析了小麥擴展蛋白基因TaEXPA2的表達對鎘脅迫的響應。結(jié)果表明,鎘脅迫下,該基因在小麥葉片中上調(diào)表達,呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢。(2)對轉(zhuǎn)基因煙草進行PCR篩選鑒定,獲得三個陽性轉(zhuǎn)基因株系。用不同濃度的CdCl_2對不同生長時期的轉(zhuǎn)基因煙草進行鎘脅迫處理,研究轉(zhuǎn)基因植株的鎘脅迫耐性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在鎘脅迫下,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)率較高,主根較長,生物量積累明顯增多;成苗期轉(zhuǎn)基因植株的光合速率及相關參數(shù)均有所改善。表明TaEXPA2的過量表達提高了轉(zhuǎn)基因煙草對鎘脅迫的耐受性。(3)接下來分析了過表達TaEXPA2基因提高轉(zhuǎn)基因植株鎘脅迫耐性的機制。在細胞水平上,電鏡分析發(fā)現(xiàn),鎘脅迫下,轉(zhuǎn)基因植株的細胞結(jié)構(gòu)受損情況小于野生型植株,具體表現(xiàn)為葉綠體、線粒體及細胞核的降解程度低于野生型,且質(zhì)壁分離現(xiàn)象少于野生型。在生理水平上,鎘脅迫下,TaEXPA2過表達轉(zhuǎn)基因煙草細胞受損傷程度明顯小于野生型,MDA含量及相對電導率也低于野生型,說明過表達轉(zhuǎn)基因煙草的膜相對比較穩(wěn)定。通過與野生型比較,我們發(fā)現(xiàn)TaEXPA2過表達轉(zhuǎn)基因煙草抗氧化能力顯著優(yōu)于野生型煙草。在鎘脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草的過氧化氫含量及超氧陰離子產(chǎn)生速率低于野生型,而超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性顯著高于野生型。證明TaEXPA2提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化能力。(4)分析了煙草植株根和葉中的鎘離子含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),鎘脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草的根和葉中鎘離子含量均低于野生型。同時,鎘脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草植株質(zhì)膜上H~+-ATP酶活性顯著高于野生型,這對于促進鎘離子的排出,減少鎘離子的積累起著重要的作用。另外,轉(zhuǎn)基因植株液泡膜上V-ATPase和PPase活性也高于野生型,這有助于鎘離子進入液泡,減少鎘離子在細胞質(zhì)內(nèi)的積累。進一步檢測了10分鐘內(nèi)細胞中鎘離子的位移變化,發(fā)現(xiàn)鎘脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草鎘離子外流現(xiàn)象較為明顯。以上結(jié)果表明,過表達該基因改善了轉(zhuǎn)基因煙草的鎘離子分布。(5)檢測了轉(zhuǎn)基因煙草脅迫相關基因的表達,這些基因包括質(zhì)膜H~+轉(zhuǎn)運基因(NtSOS,NtHKT521和NtHKT586),ROS相關基因(NTPOD和NTSOD),脯氨酸相關基因(NtP5CS)和脅迫防御相關基因(NtERD10C和NtERD10D)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),鎘脅迫下這些基因在轉(zhuǎn)基因植株中均比野生型植株表達量高。(6)進一步利用擬南芥同源基因突變體atexpa2研究了TaEXPA2同源基因突變對于鎘脅迫耐性的影響。用1mM的CdCl_2處理后,所有擬南芥植株的生長均受抑制,但是在野生型中,這種受抑制程度小于突變體植株,而大于轉(zhuǎn)基因植株。這些結(jié)果表明,TaEXPA2同源基因與植株的鎘脅迫耐性密切相關。綜上所述,我們的研究表明,小麥擴展蛋白基因TaEXPA2參與了植物對鎘脅迫耐性的調(diào)控,TaEXPA2過表達提高了轉(zhuǎn)基因煙草對鎘脅迫的耐性,TaEXPA2同源基因突變增強了擬南芥對鎘脅迫的敏感性。TaEXPA2轉(zhuǎn)基因植株鎘脅迫耐性的增強可能與其抗氧化能力的提高和鎘的吸收/轉(zhuǎn)運能力的提高有關。
【圖文】：

圖 1-1 擴展蛋白的結(jié)構(gòu)（徐筱等，2010）Fig. 1-1 The structure of expansin (Xu et al., 2010)蛋白首先被鑒定出來，它們具有細胞壁松弛-Mason et al., 1992）。在蛋白結(jié)構(gòu)上，該家族擴構(gòu)和生化特征的原型，這對于現(xiàn)代生化分子結(jié)

圖 1-2 擴展蛋白不同亞家族結(jié)構(gòu)域的比較（Choi et al., 2006）2 Comparison of different subfamily domains of expansin（Choi et al., 2006展蛋白是在研究 EXPA 和草類花粉過敏原 group-Ⅰ間敏原 group-Ⅰ歸類為 EXPB 家族（Cosgrove et al., 199軸的細胞壁幾乎沒有伸展能力，主要是在營養(yǎng)細胞中
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S512.1

【參考文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 高英;擴張蛋白與旱稻抗旱性關系的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2003年

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本文編號：2664272