發(fā)布時間：2017-03-24 09:12

  本文關鍵詞：江南卷柏GST基因家族的功能進化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：谷胱甘肽轉移酶(Glutathione S-transferases)是一類在生物體中廣泛存在的的蛋白質超家族。它在生物體內具有解毒抗逆,響應脅迫,信號傳導等重要功能。之前對于植物GST基因家族的研究主要集中在苔蘚植物(如小立碗蘚)、裸子植物(如油松)和被子植物(如楊樹),缺乏對蕨類植物的研究。本研究以江南卷柏為對象,利用序列搜索、系統(tǒng)發(fā)生分析、分子克隆、蛋白表達純化和酶活測定等方法,對江南卷柏GST基因家族進行了分子進化、基因表達、蛋白功能分析,獲得如下結果：1.在江南卷柏基因組中一共鑒定得到了65個GST基因,分屬于10個不同的亞家族：Tau、Phi、DHAR、Theta、Zeta、Lambda、EF1Bγ、Ure2p、TCHQD、Hemerythrin和Iota。通過保守結構域預測,這65個基因都具有典型的GST結構域。2.Tau類GST是江南卷柏中成員最多的亞家族,在所有陸地植物中,只有最低等的苔蘚植物小立碗蘚沒有Tau類GST的存在,其他四種具有維管結構植物都存在拷貝數(shù)最多的Tau類GST,這表明Tau類GST可能起源于維管植物。通過染色體定位,我們發(fā)現(xiàn)Tau類GST是以串聯(lián)重復的方式在江南卷柏基因組中快速擴張的。對于Phi類GST,在其他陸地植物中都有八個以上成員,而在江南卷柏中只有兩個,此外,兩個Phi類GSTs在不同pH和溫度條件下進行活性分析發(fā)現(xiàn),它們在pH 6.0-9.5,以及30-65℃范圍內均具有較高的催化活性,表明這兩個蛋白能在比較寬的環(huán)境變化條件下發(fā)揮功能,預示著這兩Phi類GST基因可能對江南卷柏適應復雜的陸地環(huán)境具有重要作用。3.組織特異性表達模式分析發(fā)現(xiàn),有41個基因在根、莖和葉三個組織中都有表達,有20個基因在三個組織中部分表達,有四個基因(SmGSTU14、SmGSTU22、 SmGSTU47、SmGSTT1)在三個組織中都不表達,表明江南卷柏GST基因家族的表達模式發(fā)生了分化。4.對重組蛋白進行誘導表達并進行酶活測定發(fā)現(xiàn),12個重組GST蛋白對CDNB都有催化活性,而對DHA沒有檢測到催化活性,并且不同的蛋白有不同的底物譜,同一亞家族內部,不同亞家族之間對底物的催化活性相差很大,說明江南卷柏GST基因家族成員之間存在著明顯的功能分化。綜合基因序列、基因結構、系統(tǒng)發(fā)育、組織特異性表達模式、蛋白質生化功能的分析,本文發(fā)現(xiàn)江南卷柏GST基因家族在基因序列、基因結構、組織特異性表達模式、蛋白質生化功能等不同層次上存在著功能分化。通過系統(tǒng)分析和染色體定位,本文揭示了GST基因家族在陸地植物中的復雜進化模式。
【關鍵詞】：谷胱甘肽轉移酶 江南卷柏 基因克隆 基因表達模式 蛋白功能分化
【學位授予單位】：北京林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 1 引言9-22
• 1.1 基因家族9-13
• 1.1.1 基因家族的形成及其擴張方式9-10
• 1.1.2 基因重復后的進化命運10-13
• 1.2 谷胱甘肽轉移酶(GST)概述13-20
• 1.2.1 GST基因家族的分類和命名13-14
• 1.2.2 GST的基因結構14
• 1.2.3 GST的蛋白結構14-15
• 1.2.4 GST的主要催化機制15-16
• 1.2.5 GST的功能16-20
• 1.2.5.1 Tau和phi類GST16-18
• 1.2.5.2 Zeta和theta類GSTs18
• 1.2.5.3 DHAR和lambda類GSTs18-19
• 1.2.5.4 TCHQD類和Ure2p類GSTs19
• 1.2.5.5 Hemerythrin類和iota類GSTs19-20
• 1.2.5.6 微粒體類GSTs20
• 1.3 江南卷柏基因組簡介20
• 1.4 本論文的目的和意義20-22
• 2 江南卷柏GST基因的鑒定和表達模式研究22-33
• 2.1 材料和方法22-24
• 2.1.1 實驗材料22
• 2.1.2 基因的搜索和鑒定22
• 2.1.3 引物設計22
• 2.1.4 總RNA的提取22-23
• 2.1.5 RNA反轉錄成cDNA23
• 2.1.6 系統(tǒng)發(fā)生關系分析23-24
• 2.1.7 序列相似性分析和基因結構分析24
• 2.1.8 江南卷柏GST基因家族的表達模式分析24
• 2.2 結果與分析24-32
• 2.2.1 序列搜索與鑒定24-25
• 2.2.2 系統(tǒng)發(fā)生分析25-26
• 2.2.3 基因結構分析26-27
• 2.2.4 Tau類GST擴張機制27-28
• 2.2.5 GST在陸地植物中的進化28-29
• 2.2.6 江南卷柏GST基因家族表達模式分析29-32
• 2.2.6.1 江南卷柏總RNA的提取29-30
• 2.2.6.2 江南卷柏GST基因家族表達模式分析30-32
• 2.3 討論32-33
• 3 江南卷柏GSTs蛋白質的功能分化研究33-44
• 3.1 實驗方法33-38
• 3.1.1 表達引物設計33
• 3.1.2 PCR擴增33
• 3.1.3 DNA回收33-34
• 3.1.4 大腸桿菌BL21感受態(tài)的制備34-35
• 3.1.5 重組表達載體的構建35-36
• 3.1.5.1 質粒的提取35
• 3.1.5.2 載體雙酶切35-36
• 3.1.5.3 連接36
• 3.1.5.4 轉化36
• 3.1.6 陽性重組子的鑒定36-37
• 3.1.7 重組蛋白的原核表達37
• 3.1.8 重組蛋白的純化37-38
• 3.1.9 重組蛋白的酶學活性檢測38
• 3.2 結果和分析38-43
• 3.2.1 江南卷柏GST基因表達載體的構建38-39
• 3.2.2 重組蛋白的誘導和純化39-40
• 3.2.3 重組蛋白的酶學活性分析40-43
• 3.2.3.1 底物活性的分析40-41
• 3.2.3.2 重組蛋白的動力學分析41
• 3.2.3.3 重組蛋白的pH依賴性和溫度依賴性分析41-43
• 3.3 討論43-44
• 4 結論44-45
• 參考文獻45-51
• 附錄51-59
• 個人簡介59-60
• 導師簡介60-62
• 致謝62

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本文編號：265392