【摘要】：在脊椎動(dòng)物心臟中,房室瓣膜的正常發(fā)育對(duì)于心臟正常的形態(tài)發(fā)生、心房和心室腔室間隔的形成、心臟電生理信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的形成等都具有關(guān)鍵的作用。在心臟收縮過程中,房室瓣膜的存在可以有效避免血液在心臟腔室之間的回流,維持心臟內(nèi)的正常血流方向,保證心臟的正常泵血功能。心臟瓣膜發(fā)育受損相關(guān)疾病在臨床上是最常見的先天性心臟病類型。在不同的脊椎動(dòng)物心臟瓣膜發(fā)育過程中,其分子調(diào)控機(jī)制復(fù)雜卻相對(duì)保守,受到多個(gè)信號(hào)通路和特異基因的共同調(diào)控。心臟收縮功能和血流等表觀遺傳因素對(duì)于心臟房室瓣膜的正常發(fā)育也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。影響心臟瓣膜發(fā)育的調(diào)控基因、相關(guān)信號(hào)通路和表觀遺傳因素等不同調(diào)控因子之間如何相互影響還有待深入闡明。發(fā)掘和深入研究潛在調(diào)控基因和信號(hào)通路是如何調(diào)控瓣膜發(fā)育的細(xì)胞和分子進(jìn)程,探究它們與已知的調(diào)控因子之間是否存在相互影響,對(duì)于研究脊椎動(dòng)物心臟瓣膜發(fā)育過程,瓣膜發(fā)育受損疾病的檢測(cè)、治療等具有重要意義。心肌肌鈣蛋白I亞基,作為心肌纖維細(xì)肌絲上肌鈣蛋白復(fù)合體的組成成分之一,在心肌收縮過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用,其在臨床上作為一個(gè)高度敏感和特異的外周血檢測(cè)指標(biāo)被廣泛應(yīng)用于心肌受損類疾病的檢測(cè)。心肌肌鈣蛋白I在維持心肌正常功能方面具有重要作用,在小鼠等哺乳動(dòng)物胚胎期和胎兒早期心臟中,主要表達(dá)的肌鈣蛋白I亞型為慢骨骼肌亞型,隨后,心肌肌鈣蛋白I亞型會(huì)逐漸替換慢骨骼肌亞型,這一替換機(jī)制目前尚未研究清楚,使得研究心肌肌鈣蛋白I在心臟發(fā)育早期的功能變得困難。另一方面,在斑馬魚胚胎期及成魚心臟中,主要表達(dá)的心肌肌鈣蛋白I亞型為tnni1b,并不存在哺乳動(dòng)物心臟中慢骨骼肌亞型向心肌亞型的替換,這使得利用斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象來研究心肌肌鈣蛋白I亞型在胚胎心臟發(fā)育早期的功能變得可行。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)在斑馬魚體內(nèi)敲除了tnni1b基因,在純合突變體胚胎中,觀察到顯著的心包水腫異常表型,心臟心管環(huán)化異常,心臟收縮功能和血流缺失,心跳減弱,心臟心內(nèi)膜環(huán)及房室瓣膜發(fā)育受損,在一周左右純合突變體胚胎中有高達(dá)88.8±6.0%的致死率。分子表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn),純合突變體胚胎心臟中,房室瓣膜發(fā)育相關(guān)的特異基因,如bmp4、cspg2、has2、notch1b、spp1,以及房室管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異表達(dá)的Alcam蛋白等在房室管形成區(qū)域的表達(dá)均出現(xiàn)異常,表明突變體胚胎心臟房室瓣膜的發(fā)育是在房室管發(fā)生階段就存在異常。在突變體胚胎心肌組織中特異性回補(bǔ)tnni1b基因,可以顯著回補(bǔ)心包水腫的異常表型,也可以回補(bǔ)瓣膜發(fā)育特異基因的異常表達(dá),進(jìn)一步證明了tnni1b基因敲除是房室瓣膜發(fā)育受損的直接原因。隨后,本研究進(jìn)一步對(duì)突變體心臟瓣膜發(fā)育受損的分子機(jī)制進(jìn)行了探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在純合突變體胚胎心臟組織中,對(duì)瓣膜發(fā)育起著重要調(diào)控作用的Wnt信號(hào)通路被抑制,在大鼠h9c2心肌細(xì)胞中敲低心肌肌鈣蛋白I,同樣能檢測(cè)到Wnt信號(hào)通路受到了抑制,這表明在不同的物種中,心肌肌鈣蛋白I對(duì)Wnt信號(hào)通路的正常激活均具有顯著調(diào)控作用,并且這種調(diào)控作用不依賴于心臟收縮或血流等表觀遺傳因素。同時(shí),在純合突變體胚胎心肌組織中,特異性的激活Wnt信號(hào)通路可以回補(bǔ)瓣膜發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)異常,進(jìn)一步證明了tnni1b基因敲除會(huì)通過抑制Wnt信號(hào)通路影響瓣膜發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá),從而導(dǎo)致心臟房室瓣膜發(fā)育受損。綜上所述,本研究首次構(gòu)建并報(bào)道了斑馬魚tnni1b基因敲除模型,觀察并記錄了基因敲除突變體胚胎的表型,發(fā)現(xiàn)該基因在斑馬魚胚胎心臟發(fā)育早期特別是房室瓣膜發(fā)育早期所具有的重要調(diào)控作用,揭示了tnni1b基因通過Wnt信號(hào)通路參與調(diào)控房室瓣膜發(fā)育這一信號(hào)調(diào)控途徑。結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究揭示了ctnniWnt這一信號(hào)途徑對(duì)房室瓣膜發(fā)育的調(diào)控并不依賴于心臟收縮或血流變化等表觀因素,這是對(duì)于心臟瓣膜發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制研究領(lǐng)域的重要發(fā)現(xiàn)。本研究填補(bǔ)了心肌肌鈣蛋白I對(duì)于胚胎心臟早期發(fā)育,特別是瓣膜發(fā)育中的功能研究這一領(lǐng)域空白,是對(duì)心肌肌節(jié)蛋白突變的致病機(jī)制研究的重要補(bǔ)充,也為臨床上瓣膜發(fā)育受損疾病的檢測(cè)和治療提供了新的分子靶點(diǎn)和理論參考。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q344

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本文編號(hào)：2653205