【摘要】：目的:應(yīng)用RRV感染Balb/c新生小鼠建立膽道閉鎖動物模型,觀察小鼠的一般狀況并檢測小鼠血清和肝臟中趨化因子的表達情況,探討疾病的病因和早期評估指標(biāo)。根據(jù)小鼠一般狀況及血清學(xué)檢測的結(jié)果選取標(biāo)本,借助基因芯片技術(shù),對膽道閉鎖小鼠肝臟標(biāo)本全基因表達譜水平和microRNA表達水平的差異進行篩選,并進行生物信息學(xué)分析和RT-PCR驗證。根據(jù)基因芯片篩選出的差異基因和生物信息學(xué)分析的結(jié)果選取目標(biāo)基因,為進一步揭示膽道閉鎖的發(fā)病機制,進行一系列的驗證實驗。方法:1、恒河猴輪狀病毒Balb/c小鼠膽道閉鎖模型的構(gòu)建及標(biāo)本收集;選取健康的新生Balb/c小鼠進行動物實驗,將生后24小時內(nèi)腹腔注射輪狀病毒者定為膽道閉鎖實驗組(n=68),腹腔注射等量病毒培養(yǎng)液者設(shè)定為正常對照組(n=72),每日觀察小鼠的病情變化并記錄體重和生存情況,分別于注射病毒后第1、3、5、7、10、14天處死小鼠并獲取血清標(biāo)本、肝外膽管標(biāo)本和肝臟標(biāo)本。2、血清總膽紅素和直接膽紅素的測定;利用相關(guān)血清膽紅素試劑盒和酶標(biāo)儀技術(shù),分別檢測兩組小鼠在不同時間點時血清中總膽紅素和直接膽紅素的水平。3、肝臟和肝外膽管組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變的觀察;對小鼠的肝臟和肝外膽管標(biāo)本進行HE染色,觀察小鼠肝臟標(biāo)本在不同時間段內(nèi)肝臟組織和肝外膽管組織結(jié)構(gòu)的改變。4、血清和肝臟中趨化因子的檢測;利用趨化因子試劑盒和流式多因子測定技術(shù),分別檢測各組在不同時間段時血清和肝臟中12個趨化因子的表達情況,并進行統(tǒng)計學(xué)分析。5、基因芯片篩選肝臟中差異表達基因和生物信息學(xué)分析;選取腹腔注射后第7天處死的小鼠并獲取肝臟標(biāo)本,膽道閉鎖實驗組和正常對照組各3例標(biāo)本。處理后的標(biāo)本與Affy GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array小鼠全基因組基因表達芯片雜交,掃描儀上掃描芯片。應(yīng)用GCBI平臺進行數(shù)據(jù)分析,分析膽道閉鎖實驗組和正常對照組小鼠肝臟組織基因表達譜間的差異,并對所得差異基因進行表達差異的顯著性分析、功能分析、信號傳導(dǎo)通路顯著性分析并構(gòu)建基因通路相互作用網(wǎng)絡(luò)。6、基因芯片篩選肝臟中差異表達的microRNA和生物信息學(xué)分析;處理后的標(biāo)本與Affy GeneChip miRNA 4.0 Array芯片進行雜交,掃描儀上掃描芯片。應(yīng)用GCBI平臺進行數(shù)據(jù)分析,分析膽道閉鎖實驗組和正常對照組小鼠肝臟組織microRNA間的表達差異,并用RT-PCR的方法對microRNA的結(jié)果進行驗證。7、對TLR7信號通路在膽道閉鎖發(fā)病過程中的功能進行驗證;分別對兩組小鼠第1、3、5、7、10、14天6個不同時間點的肝臟標(biāo)本進行石蠟包埋,連續(xù)切片后進行TLR7免疫組織化學(xué)染色;肝臟標(biāo)本經(jīng)過蛋白質(zhì)提取后對TLR7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白TLR7和P-IRF7進行Western blot檢測;肝臟標(biāo)本經(jīng)過RNA提取后用Real-time PCR來驗證關(guān)鍵基因TLR7在各組中的表達情況。用流式多因子技術(shù)檢測通路下游效應(yīng)細(xì)胞因子IFNβ、IL-6和IL-1α的表達情況。體外培養(yǎng)人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞,并用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)對細(xì)胞的TLR7基因表達進行干擾,然后用RRV感染細(xì)胞,觀察細(xì)胞病毒病變的情況。8、對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析;采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,定性資料采用獨立樣本R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗;定量資料,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s±x)表示,采用配對設(shè)計資料的t檢驗或獨立樣本資料的t檢驗。按α=0.05的檢驗水準(zhǔn),以p0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1、膽道閉鎖動物模型的構(gòu)建及臨床表型觀察;成功構(gòu)建膽道閉鎖動物模型,復(fù)制了疾病的生長遲緩、皮膚黃染及白便等臨床癥狀。2、血清總膽紅素和直接膽紅素的測定;血清膽紅素的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),膽道閉鎖小鼠的血清總膽紅素于第5天開始上調(diào)并逐漸升高,血清直接膽紅素于第7天開始上調(diào)并逐漸升高。3、肝臟和膽管組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變的觀察;肝外膽管HE染色結(jié)果顯示,第7天時膽道閉鎖組小鼠肝外膽管出現(xiàn)閉鎖和局限性擴張;第14天時膽道閉鎖組小鼠肝外膽管纖維化明顯并且膽管上皮細(xì)胞出現(xiàn)性狀的改變;而第7天時正常對照組小鼠肝外膽管直徑均勻一致,膽管上皮細(xì)胞排列整齊呈線狀。肝臟標(biāo)本HE染色結(jié)果顯示,第3天時膽道閉鎖實驗組和正常對照組肝臟內(nèi)組織結(jié)構(gòu)無明顯差異;第5天時膽道閉鎖小鼠組肝臟內(nèi)出現(xiàn)炎癥浸潤;第10、14天膽道閉鎖實驗組肝內(nèi)膽管結(jié)構(gòu)開始消失。4、肝臟和血清中12個趨化因子的表達情況;趨化因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中,CCL22、CXCL5和CXCL13在肝臟和血清中的表達,組間無明顯差異和變化趨勢;其他9個指標(biāo)中,與正常對照組相比,膽道閉鎖實驗組小鼠除CCL2、CCL20和CXCL9血清中表達上調(diào)明顯外,其他趨化因子均在肝臟中表達上調(diào)明顯。其中CCL2、CCL4、CXCL1和CXCL11于第3天開始表達上調(diào),早于血清總膽紅素;CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CXCL1、CXCL10和CXCL19從第7天起也各自出現(xiàn)表達上調(diào)。5、基因芯片篩選肝臟中差異表達基因和生物信息學(xué)分析;以p值0.05、q值0.05差異倍數(shù)在2倍以上為標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖實驗組與正常對照組小鼠肝臟相比存在254條差異表達的基因。進一步對差異基因進行生物信息學(xué)分析,其中差異表達基因的顯著功能分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn):這些差異基因的功能主要涉及先天性免疫應(yīng)答、應(yīng)對病毒反應(yīng)、防御病毒反應(yīng)、氧化還原過程、代謝過程、干擾素β的細(xì)胞應(yīng)答、病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控和免疫反應(yīng)等,其中差異最明顯的是先天性免疫應(yīng)答。進一步進行差異基因通路網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)TLR受體信號通路和凋亡信號通路的差異基因表達具有一致性上調(diào)的特點,并且在網(wǎng)絡(luò)中具有相關(guān)性。因此,對功能分析中先天性免疫應(yīng)答部分的差異基因按p值進行排序,發(fā)現(xiàn)TLR7上調(diào)最顯著,并且其下游基因IRF7也有一定程度的上調(diào)。6、基因芯片篩選肝臟中差異表達的microRNA和生物信息學(xué)分析;膽道閉鎖實驗組與正常對照組小鼠肝臟相比存在11條差異的microRNA。其中,miR-29a-3p的功能聯(lián)系最廣泛。RT-PCR驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-29a-3p、miR-293-3p、miR292-3p和miR-29b-1-5p這4個microRNA的表達有明顯表達上調(diào),并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。剩余的7個microRNA中,miR-205-5p、miR-292-5p、miR-6240、miR-290a-5p和miR-8109這5個microRNA的表達膽道閉鎖實驗組高于正常對照組;miR-708-5p和miR-1839-3p這2個micro RNA的表達膽道閉鎖組低于正常對照組。接著對RT-PCR的驗證結(jié)果進行差異倍數(shù)分析,并與芯片結(jié)果中的差異倍數(shù)進行比較,發(fā)現(xiàn)RT-PCR驗證結(jié)果中各個microRNA的表達差異倍數(shù)的趨勢與基因芯片趨勢一致,但是差異倍數(shù)的數(shù)值均低于芯片中的結(jié)果。7、對TLR7信號通路在膽道閉鎖發(fā)病過程中的功能進行驗證;免疫組化結(jié)果顯示第3、5天時膽道閉鎖實驗組和對照組間肝臟內(nèi)結(jié)構(gòu)和TLR7表達無明顯差異;第7天時膽道閉鎖組膽管上皮TLR7開始表達,并且肝內(nèi)膽管周圍出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤;第10、14天時肝內(nèi)膽管組織逐漸消失,血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,血管周圍膽管處可見明顯的TLR7陽性的炎性細(xì)胞浸潤。Western blot對TLR7蛋白表達進行半定量分析,PCR對TLR7基因的轉(zhuǎn)錄水平進行定量分析,結(jié)果一致性表現(xiàn)為TLR7于第5天出現(xiàn)上調(diào),并逐漸上升,第10、14天時達到最高。Western blot對其下游基因IRF7的激活狀態(tài)P-IRF7蛋白進行半定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)第5天開始膽道閉鎖實驗組小鼠肝臟內(nèi)的P-IRF7蛋白明顯激活,正常對照組雖然TLR7表達有一定的上調(diào),但是其下游基因P-IRF7蛋白基本無激活表現(xiàn)。流式多因子技術(shù)檢測肝臟內(nèi)細(xì)胞因子IFNβ、IL-6和IL-1α的表達情況,發(fā)現(xiàn)這三個TLR7信號通路的效應(yīng)因子從第5天開始均有不同程度的表達上調(diào)。TLR7沉默后,人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞感染RRV后的病毒病變出現(xiàn)更早并且病變更嚴(yán)重。結(jié)論:接觸病毒后第7天是膽道閉鎖小鼠發(fā)生膽道閉鎖改變的關(guān)鍵時期。大量炎癥趨化因子參與膽道閉鎖小鼠發(fā)病過程,其中CCL2、CCL4、CCL11和CXCL1上調(diào)較早,參與疾病的發(fā)生;CCL3、CCL5、CCL20、CXCL9和CXCL10上調(diào)較晚,參與疾病的發(fā)展;由此推測可以通過多指標(biāo)血清學(xué)檢測,早期對疾病進行評估。膽道閉鎖小鼠的發(fā)病與免疫反應(yīng)有密切的關(guān)系;其中先天性免疫反應(yīng)和機體應(yīng)對病毒的反應(yīng)發(fā)揮著重要的作用。其中TLR7信號通路可能在膽道閉鎖小鼠的發(fā)病過程中起到了一定的保護作用。
【圖文】：

成致密單層；接種病毒約2~3天后，細(xì)胞開始發(fā)生細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopahogeniceffect，CPE）表現(xiàn)為細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞腫脹、變圓、懸浮、胞質(zhì)混亂、核碎裂，3~5天時50%～60%的細(xì)胞發(fā)生CPE (見圖1.1 )。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文9圖1.2. （A）為第7天小鼠，左邊四只紅色箭頭所指為膽道閉鎖實驗組，右邊兩只藍色箭頭所指為正常對照組。與右側(cè)兩只正常對照組相比，左側(cè)膽道閉鎖實驗組可見皮膚黃染和生長遲緩，并且從左到右依次有不同程度加重。（B）為第14天小鼠，左邊藍色箭頭所指為正常對照組小鼠，右邊紅色箭頭所指為膽道閉鎖實驗組小鼠。與左邊正常對照組小鼠相比，右邊膽道閉鎖實驗組小鼠，，皮膚裸露區(qū)：眼瞼、前爪和鼻翼處可見明顯皮膚黃染，并且毛發(fā)油膩。（C）為第7天小鼠的腹腔解剖圖，左邊紅色箭頭所指為膽道閉鎖實驗組小鼠，右邊藍色箭頭所指為同齡的正常對照組小鼠。可見與右邊正常對照組相比
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R722.1

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本文編號：2652147