【摘要】：化學(xué)農(nóng)藥是防治病原生物方便、有效和普遍的一種方法,但在有效提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí),亦會(huì)引發(fā)許多健康和環(huán)境問(wèn)題。一些藥用植物中蘊(yùn)含大量的抗菌蛋白,克隆編碼這些蛋白的基因,通過(guò)植物基因工程技術(shù)利用這些基因,可有效降低病害對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失。本研究以我國(guó)傳統(tǒng)中草藥杜仲為材料,對(duì)杜仲幾丁質(zhì)酶家族的多個(gè)基因進(jìn)行克隆,表達(dá)分析和功能研究。本論文中取得的這些研究結(jié)果,為杜仲抗真菌研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1.杜仲幾丁質(zhì)酶基因克隆與分析本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的杜仲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析,篩選出15條可能的杜仲幾丁質(zhì)酶基因片段,以實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)示范基地種植10余年的杜仲樹(shù)為材料,于開(kāi)花結(jié)果期分別采集雌雄株幼芽、葉片、樹(shù)皮及幼果提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術(shù)擴(kuò)增目的基因的5’端和3’端序列,經(jīng)拼接后,根據(jù)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)cDNA序列。經(jīng)測(cè)序證明獲得3個(gè)具有完整開(kāi)放閱讀框的杜仲幾丁質(zhì)酶基因EuCHIT1,EuCHIT2和EuCHIT3序列長(zhǎng)度分別為1402 bp,1218 bp和1269 bp。對(duì)EuCHIT1、EuCHIT2和EuCHIT3的保守區(qū)和motif分析,結(jié)果表明EuCHIT1和EuCHIT2屬于幾丁質(zhì)酶糖苷水解酶19家族,而EuCHIT3屬于幾丁質(zhì)酶糖苷水解酶18家族。與來(lái)源于昆蟲(chóng)、細(xì)菌、真菌以及其他植物的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析,發(fā)現(xiàn)這3個(gè)杜仲幾丁質(zhì)酶均與其他植物的幾丁質(zhì)酶聚在一起,說(shuō)明他們與其他植物的幾丁質(zhì)酶具有共同的進(jìn)化祖先。2.杜仲幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)特征分別提取杜仲的根、嫩莖皮、嫩葉和老莖皮的總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA,使用qRT-PCR對(duì)杜仲各組織中的EuCHIT1、EuCHIT2、EuCHIT3的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明3個(gè)基因在嫩莖中的表達(dá)量均高于其他組織。EuCHIT1和EuCHIT 2在嫩葉中的表達(dá)量比嫩莖中的低,但高于其他組織。EuCHIT3在葉,老莖和根中的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。以鐮刀菌浸染杜仲幼苗根部,以浸染前和侵染后24、48、72和96 h杜仲幼苗感染部分以上的嫩莖為材料,利用qRT-PCR分析EuCHIT1、EuCHIT2和EuCHIT3的表達(dá)模式。結(jié)果表明,EuCHIT1和EuCHIT2的表達(dá)量在接菌后72 h達(dá)到最大值,分別為接菌前的13.6倍和5.77倍。EuCHIT3基因表達(dá)量在接種后48 h達(dá)到最大值為接菌前的2.75倍。對(duì)該樣品進(jìn)行蛋白組分分析,結(jié)果表明接種72 h后的差異表達(dá)蛋白的數(shù)量最多,上調(diào)蛋白有18個(gè),下調(diào)蛋白有69個(gè)。值得注意的是β-葡萄糖苷酶和磷脂酶Dα在接種后一直處于下調(diào)狀態(tài)。接菌后蛋白組僅僅檢測(cè)到幾丁質(zhì)酶EuCHIT2,且接菌24 h后EuCHIT2表達(dá)量下調(diào)的。GO分析發(fā)現(xiàn)膜整合蛋白、DNA轉(zhuǎn)錄激活因子和Ca~(2+)離子應(yīng)答受體在接種后被劇烈調(diào)節(jié),與植物抗病相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶被激活。KEGG分析顯示與尖孢鐮刀菌脅迫相關(guān)的幾條途徑中均上調(diào)的蛋白是結(jié)合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,Bip)。3.EuCHIT1和EuCHIT2過(guò)表達(dá)載體對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化以EuCHIT1和EuCHIT2基因構(gòu)建植物表達(dá)載體pSH-35S-EuCHIT1和pSH-35S-EuCHIT2,以農(nóng)桿菌LBA4404菌株,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tabacum CV.Xanthin),抗性植株經(jīng)Gus組織化學(xué)染色以及PCR檢測(cè)驗(yàn)證后,分別獲得EuCHIT1和EuCHIT2轉(zhuǎn)基因煙草35株和36株。4.EuCHITs對(duì)煙草幾丁質(zhì)酶活性的影響對(duì)野生型煙草和轉(zhuǎn)EuCHIT1和EuCHIT2基因煙草T1代植株,幾丁質(zhì)酶活性進(jìn)行分析。結(jié)果表明EuCHIT1和EuCHIT2基因能提高煙草總幾丁質(zhì)酶酶活。未感染病害時(shí)轉(zhuǎn)EuCHIT1基因煙草的平均酶活是野生型煙草的2.4倍,轉(zhuǎn)EuCHIT2基因煙草的平均酶活是野生型的2.11倍。但在接種煙草灰霉菌B.cinerea(Botrytis.cinerea)后野生型煙草幾丁質(zhì)酶活性的提高幅度明顯高于轉(zhuǎn)EuCHIT1基因煙草,從接菌前到6 h野生型煙草的酶活升高了1.866倍,而轉(zhuǎn)基因煙草只升高了1.19倍。轉(zhuǎn)EuCHIT2煙草在接種白粉病后幾丁質(zhì)酶的酶活相比接菌前僅僅提高了0.32倍,在接種病原真菌后轉(zhuǎn)基因和野生型煙草的幾丁質(zhì)酶活性沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明杜仲幾丁質(zhì)酶基因能夠提高煙草中的總幾丁質(zhì)酶活性,然而在接種真菌病害后,幾丁質(zhì)酶活性的增長(zhǎng)在EuCHIT1和EuCHIT2轉(zhuǎn)基因煙草中并不明顯。5.EuCHIT1和EuCHIT2基因?qū)煵菘共⌒缘挠绊憣?duì)相同生理狀態(tài)的野生型和轉(zhuǎn)EuCHIT1基因煙草離體葉片接種灰霉菌(B.cinerea,HM),發(fā)現(xiàn)接種后第二天轉(zhuǎn)基因和野生型煙草均開(kāi)始出現(xiàn)水浸樣病斑,隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)病斑擴(kuò)大,整個(gè)染病過(guò)程中以第4天的病征差異最大,接菌后第4天,野生型煙草病斑直徑和3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系EuCHIT1-31、EuCHIT-37和EuCHIT-151病斑直徑平均值分別為2.6、1.2、1.8和1.7 cm,轉(zhuǎn)基因植株的病斑直徑菌顯著小于野生型,說(shuō)明過(guò)表達(dá)EuCHIT1顯著提高了煙草對(duì)灰霉菌的抗性。野生型煙草和轉(zhuǎn)EuCHIT2基因煙草葉片在接種煙草白粉菌(Erysiphe cichoracearum DC)后的前兩天,均未見(jiàn)病斑形成。接種第3天,野生型和其中一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系EuCHIT2-2葉片上開(kāi)始出現(xiàn)病斑,且野生煙草葉片上的病斑明顯大于轉(zhuǎn)基因煙草,隨時(shí)間延長(zhǎng)病斑增大。在接種第12天時(shí)野生型煙草表面布滿白粉菌菌絲和孢子,而轉(zhuǎn)基因煙草葉片的表面菌絲和孢子相對(duì)較少。測(cè)量單位面積病葉上的孢子數(shù)量分別為株系EuCHIT2-1、69444個(gè)/cm~2;株系EuCHIT2-2、186111個(gè)/cm~2和株系EuCHIT2-15、33333個(gè)/cm~2;野生型、327778個(gè)/cm~2,說(shuō)明過(guò)表達(dá)EuCHIT2能夠提高煙草對(duì)白粉菌的抗性。6.EuCHITs對(duì)煙草病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響利用qRT-PCR對(duì)接種煙草灰霉菌前后野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株抗病相關(guān)的病程相關(guān)蛋白(pathogenesis related protein 1a,PR-1a)基因和冠癭瘤不敏感基因(Coronatine insensitive 1,COI1)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)EuCHIT1煙草接菌前三個(gè)株系的COI1基因的相對(duì)表達(dá)量分別是野生型的1.75,2.04和2.28倍。但轉(zhuǎn)基因煙草在接種灰霉菌后COI1基因的表達(dá)量相對(duì)于接種前顯著降低。說(shuō)明過(guò)表達(dá)EuCHIT1基因能夠提高接菌前煙草中COI1基因的相對(duì)表達(dá)量,而接菌后過(guò)表達(dá)EuCHIT1對(duì)煙草的COI1基因表達(dá)有抑制作用。對(duì)PR-1a相對(duì)表達(dá)量的分析結(jié)果表明,3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在接菌前的相對(duì)表達(dá)量分別是野生型的4.75,3.84和2.74倍。轉(zhuǎn)基因煙草PR-1a的表達(dá)量在72 h時(shí)達(dá)到最高,是野生型煙草最高值(6h)的33.8倍。說(shuō)明轉(zhuǎn)入EuCHIT1的煙草在接種灰霉菌前后都增加了PR-1a的表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)EuCHIT2基因煙草和野生型煙草感染白粉病前后的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果表明接菌前3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系的COI1基因相對(duì)表達(dá)量分別是野生型的1.31,2.07和1.2倍。接種白粉病后野生型煙草的COI1基因在24 h達(dá)到峰值,相對(duì)表達(dá)量為接菌前的3.6倍。轉(zhuǎn)基因煙草在接種白粉病后COI1基因相對(duì)表達(dá)量反而下調(diào),說(shuō)明EuCHIT2基因能夠提高接菌前煙草COI1基因的相對(duì)表達(dá)量,但接種白粉病后轉(zhuǎn)基因煙草中的COI1基因的相對(duì)表達(dá)量反而被抑制。PR-1a的相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果表明,在接菌前3個(gè)株系轉(zhuǎn)基因煙草的PR-1a相對(duì)表達(dá)量分別是野生型煙草的2.67,1.23和2.29倍。接菌72 h后3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系的中PR-1a的相對(duì)表達(dá)量分別是野生型的307.22,112.22和146.67倍,接菌后轉(zhuǎn)基因煙草中PR-1a的相對(duì)表達(dá)量明顯高于野生型煙草中PR-1a的相對(duì)表達(dá)量。說(shuō)明在EuCHIT2提高對(duì)煙草白粉病的抗性,可能與促進(jìn)PR-1a表達(dá)量提高有關(guān)。7.EuCHIT1和EuCHIT2對(duì)煙草保護(hù)性酶活性的影響對(duì)過(guò)氧化物酶(Peroxidase,POD),過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)的酶活和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量測(cè)定結(jié)果表明。在對(duì)轉(zhuǎn)EuCHIT1煙草和野生型煙草的比較中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中CAT的活性在接種灰霉菌72 h為122.40 U/g,顯著高于野生型煙草中的酶活50.49 U/g。這一結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)入EuCHIT1基因,能顯著提高煙草在感染灰霉菌后的CAT酶活性,對(duì)感染的植物細(xì)胞膜起到了保護(hù)作用。接菌前轉(zhuǎn)基因煙草葉片的MDA的含量為5.7 mmol/g,顯著低于野生型煙草(9.4 mmol/g)(P0.05),接菌72 h轉(zhuǎn)基因煙草的MDA的含量為8.7 mmol/g顯著低于同一時(shí)間的野生型煙草(10.5mmol/g)。在對(duì)轉(zhuǎn)EuCHIT2的轉(zhuǎn)基因煙草及野生型的比較中,接種白粉菌前的轉(zhuǎn)EuCHIT2煙草POD活性和接菌后12和24 h均高于野生型煙草的酶活,分別為5158和3425 U/g;8625和4716 U/g;10816和3450 U/g。并且在接種前和接種后轉(zhuǎn)EuCHIT2基因煙草中的MDA的含量均低于野生型。上述結(jié)果說(shuō)明在EuCHIT1和EuCHIT2介導(dǎo)的抗煙草真菌病害的過(guò)程中,能提高煙草的POD或CAT酶的活性來(lái)避免超敏反應(yīng)對(duì)植物細(xì)胞的損壞。
【圖文】：

的煙草(Nicotiana tabacum)中(Loon and Kammen 1970a, Gianinazzi et al. 1970) 發(fā)現(xiàn)首個(gè)病程相關(guān)蛋白（PR1a）（圖1.1）。后續(xù)通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳, 分離并比較感染 TMV前后煙草的可溶性的蛋白，，

98 °C 10 Sec 15-30 Cycle68 °C 30 Sec/kb68 °C 7 min3）杜仲幾丁質(zhì)酶基因載體 pSH737-35s-EuCHITs的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)室保存的植物表達(dá)載體是 pSH737 (圖. 2.1) 是一種雙源載體。包含主中進(jìn)行復(fù)制的位點(diǎn)和一個(gè)來(lái)至于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子 Tn903 的卡那霉( Neomycin Phosphotransferase I, NPT I )用于細(xì)菌的選擇。還含有一個(gè)來(lái)自（Escherichia coli, E.coli）的免疫組化報(bào)告基因，β-葡糖醛酸糖苷酶（β-gGUS)。載體中還含有來(lái)自于另一個(gè)來(lái)自于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子 Tn5 的卡那霉素（NeomyPcin hosphotransferase II, NPT II） 用于在植物中進(jìn)行選擇。嵌合體學(xué) 報(bào)告 基因 和 卡 那 霉素 抗 性基 因 GUS::NPT II 均 由 花 椰 菜 病 毒的（cauliflower mosaic virus, CaMV） 啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.671

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2637004