本文關(guān)鍵詞：碳納米管作為重組質(zhì)粒pEGFP-vp5基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著基因功能研究的深入,細(xì)菌轉(zhuǎn)化、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基因功能研究的基本方法,尋找一種攜載率高、穿膜能力強(qiáng)、成本低、細(xì)胞毒性小的載體作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體,對基因功能的研究和應(yīng)用具有重要意義。功能化碳納米管(Functionalized Carbon nanotubes,f-CNTs)可以有效地為藥物、氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物活性分子提供連接位點(diǎn),并攜載其穿透組織、細(xì)胞的膜屏障順利進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用。vp5基因表達(dá)產(chǎn)物為草魚呼腸孤病毒(GCRV)VP5外殼蛋白,由于具有良好的免疫原性成為草魚出血病疫苗研究的焦點(diǎn)。本研究通過化學(xué)修飾的功能化碳納米管連接重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-vp5系統(tǒng)進(jìn)行大腸桿菌(BL21)轉(zhuǎn)化、草魚腎細(xì)胞(CIK)轉(zhuǎn)染、進(jìn)一步浸浴草魚,基于轉(zhuǎn)染效率、免疫保護(hù)作用等篩選合適的碳納米管載基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),并驗(yàn)證碳納米管作為載體的基因轉(zhuǎn)運(yùn)效果。取得的結(jié)果如下:1.采用真核重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-vp5,并經(jīng)靜電吸附作用與四種不同側(cè)鏈修飾的氨基化多壁碳納米管(MWCNTs-NH3+:S1、S2、S3、S4)進(jìn)行連接,制備碳納米管載基因系統(tǒng)(MWCNTs-pEGFP-vp5),MWCNTs-pEGFP-vp5經(jīng)孵育轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21),結(jié)果顯示:S4攜帶重組質(zhì)粒pEGFP-vp5轉(zhuǎn)化大腸桿菌,轉(zhuǎn)化效果極好;兩者的最佳配比(S4:DNA)為8:1;重組質(zhì)粒pEGFP-vp5的適宜用量為20 ng;操作簡便、成本較低。說明氨基化多壁碳納米管有望成為優(yōu)良的細(xì)菌轉(zhuǎn)化載體。2.四種不同修飾的MWCNTs-NH3+(S1、S2、S3、S4)承載重組質(zhì)粒pEGFP-vp5構(gòu)成碳納米管載基因系統(tǒng)(MWCNTs-pEGFP-vp5),MWCNTs-pEGFP-vp5經(jīng)溫育轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞。瓊脂糖凝膠電泳測定結(jié)果表明:氨基化碳納米管可以不同程度吸附質(zhì)粒pEGFP-vp5;掃描電子顯微鏡圖像顯示:CIK細(xì)胞對MWCNTs-NH3+存在很大的親和力,碳納米管覆蓋在細(xì)胞表面且多數(shù)垂直插在胞膜上,像針一樣刺入細(xì)胞;透射電子顯微鏡圖像證實(shí):MWCNTs-NH3+穿透了細(xì)胞膜,并且分散到了CIK細(xì)胞中。隨后的研究證實(shí),MWCNTs的修飾方式及其與質(zhì)粒DNA配比是決定轉(zhuǎn)染效率的重要因素,S4顯示較好的轉(zhuǎn)染效果,其與質(zhì)粒DNA最佳配比為6:1。氨基化多壁碳納米管有望成為優(yōu)良的細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體。3.基于氨基化多壁碳納米管(S4)、氨基化單壁碳納米管(修飾方法同S4)和質(zhì)粒pEGFP-vp5組成了碳納米管載核酸疫苗系統(tǒng)(CNTs-pEGFP-vp5),將CNTs-pEGFP-vp5經(jīng)肌肉注射和浸浴免疫草魚,結(jié)果表明:S4不適合作為pEGFP-vp5疫苗的載體免疫草魚;對于氨基化單壁碳納米管(SWCNTs-NH3+),SWCNTs-pEGFP-vp5免疫組相比質(zhì)粒pEGFP-vp5免疫組vp5基因的表達(dá)水平、特異性抗體水平、免疫相關(guān)基因表達(dá)水平及相對存活率均顯著增高;此外,SWCNTs-pEGFP-vp5(5μg/尾)肌肉注射免疫組和SWCNTs-pEGFP-vp5(20 mg/L)浸浴免疫組均觀察到良好的免疫保護(hù)作用,浸浴免疫達(dá)到了注射免疫的效果。氨基化SWCNTs可以作為水產(chǎn)核酸疫苗的有效載體,通過浸浴免疫達(dá)到肌肉注射免疫的免疫保護(hù)效果,其在水產(chǎn)疫苗方面有廣闊的應(yīng)用前景。綜上所述,利用碳納米管的細(xì)胞穿透性,經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的碳納米管可以作為外源基因pEGFP-vp5在大腸桿菌BL21、CIK細(xì)胞甚至草魚活體中基因轉(zhuǎn)運(yùn)的載體。為功能化碳納米管作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：碳納米管 pEGFP-vp5 細(xì)菌轉(zhuǎn)化 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 免疫保護(hù)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-21
• 1.1 草魚出血病病原簡介12
• 1.2 草魚出血病預(yù)防和控制12-13
• 1.3 基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法13-14
• 1.4 碳納米管載體簡介14-15
• 1.4.1 碳納米管的制備方法15
• 1.5 碳納米管的細(xì)胞穿透機(jī)制15-16
• 1.5.1 打孔式穿過胞膜15
• 1.5.2 依賴能量的內(nèi)吞作用15-16
• 1.5.3 能量不依賴的非內(nèi)吞作用16
• 1.5.4 擴(kuò)散作用16
• 1.6 碳納米管的功能化修飾16-17
• 1.6.1 共價修飾16-17
• 1.6.2 非共價修飾17
• 1.7 功能化碳納米管在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用17-19
• 1.7.1 作為藥物分子載體的研究17-18
• 1.7.2 協(xié)助多肽和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的研究18
• 1.7.3 協(xié)助基因轉(zhuǎn)運(yùn)的研究18-19
• 1.8 碳納米管對水生生物的毒性研究19
• 1.9 選題的目的和意義19-21
• 第二章 碳納米管載重組質(zhì)粒pEGFP-vp5轉(zhuǎn)化大腸桿菌的研究21-29
• 2.1 材料與方法21-24
• 2.1.1 試驗(yàn)材料21
• 2.1.2 主要試劑和儀器21
• 2.1.3 草魚呼腸孤病毒vp5基因的擴(kuò)增21-22
• 2.1.4 重組質(zhì)粒pEGFP-vp5的構(gòu)建及鑒定22-23
• 2.1.5 功能化碳納米管的修飾23-24
• 2.1.6 碳納米管載pEGFP-vp5轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建24
• 2.1.7 碳納米管對大腸桿菌的毒性評估24
• 2.1.8 最優(yōu)碳納米管種類及配比的篩選24
• 2.2 結(jié)果與分析24-28
• 2.2.1 重組質(zhì)粒pEGFP-vp5構(gòu)建與鑒定24-25
• 2.2.2 功能化碳納米管的結(jié)構(gòu)25-26
• 2.2.3 最優(yōu)碳納米管修飾方式26
• 2.2.4 S4與重組質(zhì)粒pEGFP-vp5的最佳配比26-27
• 2.2.5 重組質(zhì)粒的合適用量27-28
• 2.3 討論28
• 2.4 小結(jié)28-29
• 第三章 碳納米管載重組質(zhì)粒pEGFP-vp5轉(zhuǎn)染草魚腎細(xì)胞（CIK）的研究29-36
• 3.1 材料與方法29-31
• 3.1.1 試驗(yàn)細(xì)胞29
• 3.1.2 主要試劑和儀器29
• 3.1.3 多壁碳納米管的氨基化修飾29
• 3.1.4 重組質(zhì)粒pEGFP-vp5的構(gòu)建29
• 3.1.5 MWCNTs-NH3+: pEGFP-vp5復(fù)合物的制備29-30
• 3.1.6 凝膠電泳分析MWCNTs-NH3+:DNA的最佳配比30
• 3.1.7 掃描電鏡和透射電鏡分析樣品的制備30
• 3.1.8 RT-PCR檢測vp5在CIK細(xì)胞中的表達(dá)30-31
• 3.1.9 統(tǒng)計(jì)分析31
• 3.2 結(jié)果與分析31-34
• 3.2.1 MWCNTs-NH3+: pEGFP-vp5復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳31
• 3.2.2 掃描電鏡和透射電鏡分析31-32
• 3.2.3 MWCNTs-NH3+遞送質(zhì)粒pEGFP-vp5進(jìn)入細(xì)胞能力的評估32-33
• 3.2.4 vp5基因在CIK細(xì)胞中的表達(dá)33-34
• 3.3 討論34-35
• 3.4 小結(jié)35-36
• 第四章 碳納米管載重組質(zhì)粒pEGFP-vp5免疫草魚的研究36-53
• 4.1 材料與方法36-40
• 4.1.1 試驗(yàn)病毒與動物36
• 4.1.2 主要試劑和儀器36-37
• 4.1.3 單壁碳納米管的氨基化修飾37
• 4.1.4 重組質(zhì)粒pEGFP-vp5的構(gòu)建37
• 4.1.5 碳納米管載pEGFP-vp5疫苗系統(tǒng)的構(gòu)建37
• 4.1.6 碳納米管載疫苗毒性評估37-38
• 4.1.7 碳納米管載核酸疫苗免疫草魚38
• 4.1.8 肌肉組織中重組質(zhì)粒檢測38
• 4.1.9 肌肉組織中重組質(zhì)粒表達(dá)檢測38
• 4.1.10 免疫相關(guān)基因表達(dá)的測定38-39
• 4.1.11 抗體效價測定39
• 4.1.12 攻毒試驗(yàn)及病毒的檢測39-40
• 4.1.13 統(tǒng)計(jì)分析40
• 4.2 結(jié)果與分析40-50
• 4.2.1 毒性評估40
• 4.2.2 肌肉組織內(nèi)pEGFP-vp5的持久性40-41
• 4.2.3 肌肉組織內(nèi)vp5基因的表達(dá)41-43
• 4.2.4 免疫相關(guān)基因的表達(dá)分析43-44
• 4.2.5 疫苗的免疫保護(hù)44-47
• 4.2.6 抗體效價測定47-48
• 4.2.7 不同組織中病毒的檢測48-50
• 4.3 討論50-52
• 4.4 小結(jié)52-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 附錄60-63
• 致謝63-64
• 作者簡介64

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王元;碳納米管作為重組質(zhì)粒pEGFP-vp5基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：碳納米管作為重組質(zhì)粒pEGFP-vp5基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：263664