【摘要】：白樺三萜因其具有的抗腫瘤和抗艾滋病毒等活性,而成為最有潛力的藥物制劑,具有重要的應(yīng)用前景。轉(zhuǎn)錄因子具備通過調(diào)控途徑基因的表達(dá)量,進(jìn)而調(diào)節(jié)次生代謝物質(zhì)產(chǎn)量的功能,是常用的從整體改造代謝途徑的一種有效工具。本研究以白樺(Betula platyphlla Suk.)為材料,結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期篩選的響應(yīng)MeJA和SA信號(hào)的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因,擬克隆與白樺三萜合成相關(guān)的BpMYB21和BpMYB61基因全長(zhǎng)及啟動(dòng)子序列,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,表達(dá)特異性分析,研究其在白樺和酵母中的表達(dá)特征及功能。以期為白樺三萜類物質(zhì)代謝工程遺傳改造和生物技術(shù)利用提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。本研究結(jié)果如下:1.利用特異引物和RT-PCR技術(shù),從白樺組培苗cDNA中克隆了白樺BpMYB21和BpMYB61基因的cDNA全長(zhǎng)。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),BpMYB21基因的ORF全長(zhǎng)為1014 bp,編碼337個(gè)氨基酸,該蛋白質(zhì)具有一個(gè)MYB binding site和兩個(gè)SANT超家族,為親水性蛋白,與胡桃MYB30-Like具有64%的相似性,與胡楊MYB86的相似性為61%。BpMYB61基因的ORF長(zhǎng)為1203bp,編碼400個(gè)氨基酸,具有兩個(gè)MYB binding site保守結(jié)構(gòu)域,為親水性蛋白,與光皮樺myb-Like的同源性最高為97%。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,BpMYB21轉(zhuǎn)錄因子與胡桃,而BpMYB61與光皮樺MYB基因在一個(gè)分支上。進(jìn)一步分析表明,本研究獲得的BpMYB21是白樺MYB家族中的新成員。2.利用Real-time PCR技術(shù),分析了BpMYB21和BpMYB61基因時(shí)空及激素處理表達(dá)模式。結(jié)果表明,在六月中旬至九月中旬期間,三年樹齡的白樺植株中,BpMYB21和BpMYB61基因均在7、8月份表達(dá)量較高。兩個(gè)基因的組織特異性表達(dá)分析表明,莖和葉中的表達(dá)水平顯著高于根中的表達(dá)水平。BpMYB21和BpMYB61兩個(gè)基因?qū)Σ煌に卣T導(dǎo)的響應(yīng)模式差異顯著。在葉中,除ABA和GA處理12h時(shí)BpMYB21基因的表達(dá)量最高,其余處理均為6h時(shí)BpMYB21基因表達(dá)量最高;在莖中,ABA和乙烯在處理12h時(shí)BpMYB21基因的表達(dá)量達(dá)到最高,其余處理均為6h時(shí)BpMYB21基因的表達(dá)量達(dá)到最高。在葉中,除了乙烯和傷害處理6h,BpMYB61基因的表達(dá)量最高外,其余處理均在12h,基因的表達(dá)量達(dá)最高;在莖中,ABA、MeJA、SA的處理使BpMYB61的表達(dá)量下調(diào),而GA、乙烯、傷害處理上調(diào)BpMYB61基因的表達(dá)。通過亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn),明確白樺BpMYB21和BpMYB61在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均有表達(dá)。3.通過染色體步移技術(shù)分別擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為1302bp和850bp的BpMYB21、BpMYB61基因的啟動(dòng)子序列。這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子序列分析結(jié)果表明,BpMYB21和BpMYB61啟動(dòng)子包含TATA盒和CAAT盒等基本元件。同時(shí)得到多個(gè)植物激素應(yīng)答元件,如赤霉素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸響應(yīng)元件。還存在干旱、熱脅迫、厭氧菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件等防御與脅迫相關(guān)的表達(dá)元件等。此外發(fā)現(xiàn),BpMYB21和BpMYB61基因啟動(dòng)子序列中還存在MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的位點(diǎn)MBS元件以及bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)G-Box元件,暗示兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子之間及與bHLH類轉(zhuǎn)錄因子可能存在互作。4.以pYES3/CT質(zhì)粒為載體分別得到BpMYB21和BpMYB61的酵母表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)化INVScl,INVScl-pYES2-SS,INVScl-pYES2-SE酵母菌株。重組酵母細(xì)胞中的角鯊烯和總?cè)坪糠治霰砻?與對(duì)照INVScl-pYES3酵母菌株相比,上述六種重組酵母菌中的角鯊烯和總?cè)坪烤胁煌潭忍岣?其中BpMYB21重組酵母INVScl-pYES-MYB21-SS角鯊烯含量最高,比對(duì)照菌株INVScl-pYES3提高了 89%;在BpMYB61重組酵母INVScl-pYES3-MYB61中角鯊烯含量最高,比對(duì)照酵母INVScl-pYES3提高了78%;BpMYB21重組酵母INVScl-pYES-MYB21-SS中總?cè)坪勘葘?duì)照酵母INVScl-pYES3提高20%;BpMYB61重組酵母INVScl-pYES3-MYB61總?cè)坪勘葘?duì)照INVScl-pYES3 酵母提高 23%。5.利用 pCAMBIA1303-BpMYB21 和 pCAMBIA1303-BpMYB61 農(nóng)桿菌分別侵染白樺組培苗的葉片、葉柄和莖段,分別獲得pCAMBIA1303-BpMYB21和pCAMBIA1303-BpMYB61抗性植株44株和45株,經(jīng)PCR鑒定分別各獲得4株和7株轉(zhuǎn)基因苗。利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) pCAMBIA1303-BpMYB21 和 pCAMBIA1303-BpMYB61 轉(zhuǎn)基因白樺苗中均有不同程度上調(diào)。在轉(zhuǎn)基因植株MYB21-44中,三萜途徑關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)出不同程度的上調(diào),其中上調(diào)效果最為顯著的是HMGR基因,是對(duì)照組的28.24倍;而SE基因的表達(dá)量出現(xiàn)了輕微的下調(diào)。在轉(zhuǎn)基因植株MYB61-5中,三萜途徑關(guān)鍵酶基因FPS和SS的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào),分別比對(duì)照提高了 35%和13%,而HMGR、BPW、SE、BPY的基因表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的下調(diào),其中下調(diào)效果最為顯著的為BPY基因,比對(duì)照下調(diào)了 84%。暗示兩個(gè)基因在調(diào)控三萜合成中的功能不同。6.從白樺三萜合成關(guān)鍵酶基因中篩選得到6種MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件,并成功構(gòu)建了 pHis-元件的誘餌載體。實(shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建了捕獲載體pGADT7-Rec2-MYB21和pGADT7-Rec2-MYB61,互作實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1號(hào)和4號(hào)元件分別存在于SE基因啟動(dòng)子和BPX基因的啟動(dòng)子,兩個(gè)元件與BpMYB21存在微弱的互作,而與BpMYB61存在較強(qiáng)的互作。暗示BpMYB21、BpMYB61對(duì)SE基因和BPX基因具有調(diào)控作用,而BpMYB61的調(diào)控作用可能更強(qiáng)。
【圖文】：

圖１－２植物萜類生物合成途徑｜４４］逡逑１．３植物次生代謝途徑的調(diào)控逡逑植物中有蛋白質(zhì)等植物初級(jí)代謝產(chǎn)物，還有萜類等植物次生代謝產(chǎn)物，，但這些活性逡逑成分在植物中的含量一般都很低｜４５］，因此目前亟待解決的問題就是如何提高植物次生代逡逑謝產(chǎn)物的含量。眾所周知，植物次生代謝產(chǎn)物的合成不是一個(gè)單一的過程，其中有很多逡逑調(diào)控因子發(fā)揮著作用，例如生物和非生物因子［４６］。例如，植物萜類次生代謝產(chǎn)物的合逡逑成，不僅受到ＭＶＡ途徑多種酶促反應(yīng)和關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響，更受到如茉莉酸逡逑（ＪＡ）、水楊酸（ＳＡ）等激素１４］這類的外源誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)以及如轉(zhuǎn)錄因子ｂＨＬＨ、逡逑ＷＲＫＹ、ＡＰ２等的調(diào)控［４７］。其中，萜類合成的關(guān)鍵酶基因起直接作用，而外源誘導(dǎo)子則逡逑可以間接地調(diào)控萜類物質(zhì)的合成。逡逑１．３．１外源誘導(dǎo)子的調(diào)控作用逡逑細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由外源誘導(dǎo)子信號(hào)（如病原菌，激素信號(hào)等）及與信號(hào)分子結(jié)合的逡逑受體兩部分所啟動(dòng)，下游的靶基因隨之被誘導(dǎo)表達(dá)，并產(chǎn)生響應(yīng)的次生代謝產(chǎn)物［４８］。茉逡逑

ＭＹＢ６１－Ｆ）：邋５＇－邋ＧＣＴＣＴＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＧＧＣＡＣＴ－３，逡逑ＭＹＢ６１－Ｒ）：邋５’－ＴＴＡＡＧＴＡＴＧＴＣＣＡＡＡＧＧＣＣＧＣ邋－３＇逡逑和基因生物信息學(xué)分析逡逑ＥｘＰＡＳｙ、ＳＯＰＭＡ等生物信息網(wǎng)站，ＤＮＡＭＡＮ８．０生和辦基因的全長(zhǎng)ｃＤＮＡ序列及其氨基酸理化特性等分析和預(yù)測(cè)。逡逑析逡逑／邋ｃＤＮＡ全長(zhǎng)克隆及生物信息學(xué)分析逡逑２／基因全長(zhǎng)的獲得逡逑錄組數(shù)據(jù)庫(kù)基因己知序列兩端設(shè)計(jì)特異引ｃＤＮＡ為模板，ＰＣＲ擴(kuò)增后，得到的目標(biāo)擴(kuò)增條帶（性條帶的長(zhǎng)度為１１１７ｂｐ，命名為辦ＧｅＭ邐１邐２逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S792.153

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2623635