【摘要】：三疣梭子蟹是我國重要的海水養(yǎng)殖蟹類,池塘養(yǎng)殖三疣梭子蟹卵巢發(fā)育不良是困擾該產(chǎn)業(yè)的重要問題。雌二醇是甲殼動物體內(nèi)十分重要的性類固醇激素,在卵巢發(fā)育過程中起到十分重要的作用。盡管池塘養(yǎng)殖三疣梭子蟹卵巢發(fā)育不良可能與雌二醇(E_2)分泌不足有關,但有關于其作用機制所知甚少。本研究首先采用免疫熒光的方法研究了三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中E_2在卵巢、肝胰腺、胸神經(jīng)節(jié)、腦神經(jīng)節(jié)和大顎器中的分布及變化規(guī)律;此后,通過離體和活體實驗研究了E_2對三疣梭子蟹卵巢發(fā)育、卵黃蛋白原(Vg)和雌激素相關受體(ERR)基因表達的影響;最后通過RNAi實驗初步探討了ERR基因在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中可能作用。具體研究結果如下:1.三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中E_2的免疫定位本研究采用免疫組化的方法系統(tǒng)研究了卵巢發(fā)育過程中E_2在卵巢、肝胰腺、胸神經(jīng)節(jié)、腦神經(jīng)節(jié)和大顎器中的分布及變化。結果表明:(1)卵巢中E_2的免疫陽性主要分布于濾泡細胞和卵巢發(fā)育中后期的卵母細胞胞質(zhì)(II-V期),隨著卵巢的發(fā)育,卵母細胞胞質(zhì)中的E_2免疫陽性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,而濾泡細胞中則一直存在較強的E_2免疫陽性;(2)在肝胰腺(I-IV期)中,E_2的免疫陽性主要分布于F細胞及R細胞核中,其最大免疫陽性出現(xiàn)在卵巢發(fā)育IV期的肝胰腺中;(3)在神經(jīng)組織(I-IV期)中,E_2主要分布于胸神經(jīng)團的神經(jīng)細胞和神經(jīng)髓質(zhì)以及腦神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細胞的胞核內(nèi),并始終保持著強免疫陽性反應;(4)在大顎器(I-IV期)中,E_2強免疫陽性始終存在于大顎器腺細胞的核仁以及核周圍的細胞質(zhì)內(nèi)。以上結果暗示,卵巢、肝胰腺、胸神經(jīng)團、腦神經(jīng)節(jié)和大顎器可能是三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中E_2的主要作用靶點,不同靶器官間可能存在復雜的相互作用來共同調(diào)控卵巢發(fā)育。2.E_2對三疣梭子蟹卵巢發(fā)育相關基因表達的影響通過活體注射和離體調(diào)控兩種手段來研究E_2對三疣梭子蟹卵巢發(fā)育、ERR和Vg基因表達的影響。結果表明:(1)對處于卵巢發(fā)育III期中期的三疣梭子蟹而言,不同濃度的外源E_2活體注射,對其卵巢指數(shù)和肝胰腺指數(shù)無顯著影響;(2)注射不同濃度的外源E_2對卵巢和肝胰腺中ERR和Vg mRNA的表達量有顯著影響,主要表現(xiàn)為不同濃度的外源E_2可促進卵巢和肝胰腺中Vg-mRNA的表達量顯著升高,而ERR-mRNA的表達量則顯著下降;(3)在神經(jīng)組織和大顎器中,不同濃度的外源E_2均會降低ERR的表達量,推測E_2是通過調(diào)節(jié)ERR和Vg兩種基因的拮抗表達來調(diào)控卵巢發(fā)育;(4)取卵巢發(fā)育處于III期的三疣梭子蟹的卵巢進行離體調(diào)控實驗,結果表明10-8mol/L E_2可以顯著提高卵巢中ERR-mRNA的表達水平。3.離體條件下三疣梭子蟹ERR RNA干擾體系的建立及其功能的初探首先通過體外逆轉錄合成3個不同的ERR dsRNA干擾片段,在26°C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),取III期卵巢離體干擾1h、2h、4h、8h,結果發(fā)現(xiàn)有一條干擾片段持續(xù)有效,干擾片段的濃度為2μg/ml。此后,對卵巢發(fā)育處于III期的卵巢組織進行4種不同處理的離體培養(yǎng),分別為:2μg GFP dsRNA(A組)、2μg ERR dsRNA(B組)、2μg ERR dsRNA和10-8mol/L的E_2聯(lián)用組(C組)及10-8mol/L E_2組(D組),結果發(fā)現(xiàn),與A組相比,B組和C組中ERR基因的表達量顯著下降,而D組ERR基因的表達量顯著升高。這說明在本研究中篩選的ERR dsRNA可有效降低卵巢中ERR-mRNA的表達水平,10-8mol/L E_2可以顯著提高卵巢中ERR-mRNA的表達水平。以上結果表明ERR在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育的調(diào)控過程中起到十分重要的作用,E_2可能是通過作用于ERR的信號通路來調(diào)控卵黃發(fā)生,相關調(diào)控路徑還需要進一步深入研究。
【圖文】：

圖1-2 ERα和ERβ 結構 意圖(Muramatsu and Inoue, 2000; Tong et al, 2002).3.2 雌激素膜受體1977 年，Pietras 等發(fā)現(xiàn)給予刺激后細胞內(nèi)的基因水平將會迅速上調(diào)，因此可能存在膜性 ER(membrane estrogen receptor, mER)。隨后，很多學者運用抗體結合、激光共聚焦等手段均證實了膜性 ER 的存在，并且發(fā)現(xiàn)雌激素膜受占 2%~3% (Pappas et al, 1995; Razandi et al, 1999)。核受體類似型膜受體可能核受體在轉錄過程中具有不同的剪切方式所造成的也可能是由核受體變異而的。mGPER1 是真正的 mER，mGPER1 與配體結合時均具有 mER 的特性，，，其他檢測方法也提示其主要位于細胞膜上(Gobeil et al, 2006)。.3.3 雌激素的作用機制研究發(fā)現(xiàn)，雌激素的信號轉導路徑非常復雜。主要的雌激素信號轉導路徑有兩種即：基因組途徑和非基因組途徑(圖 1-3)。

圖1-2 ERα和ERβ 結構 意圖(Muramatsu and Inoue, 2000; Tong et al, 2002)1.3.2 雌激素膜受體1977 年，Pietras 等發(fā)現(xiàn)給予刺激后細胞內(nèi)的基因水平將會迅速上調(diào)，因此推測可能存在膜性 ER(membrane estrogen receptor, mER)。隨后，很多學者運用抗原抗體結合、激光共聚焦等手段均證實了膜性 ER 的存在，并且發(fā)現(xiàn)雌激素膜受體只占 2%~3% (Pappas et al, 1995; Razandi et al, 1999)。核受體類似型膜受體可能是由核受體在轉錄過程中具有不同的剪切方式所造成的也可能是由核受體變異而形成的。mGPER1 是真正的 mER，mGPER1 與配體結合時均具有 mER 的特性，同時，其他檢測方法也提示其主要位于細胞膜上(Gobeil et al, 2006)。1.3.3 雌激素的作用機制研究發(fā)現(xiàn)，雌激素的信號轉導路徑非常復雜。主要的雌激素信號轉導路徑主要有兩種即：基因組途徑和非基因組途徑(圖 1-3)。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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