【摘要】：花鱸(Lateolabrax maculatus)為廣鹽性海水魚,易養(yǎng)殖,經(jīng)濟效益高,是我國重要的經(jīng)濟魚類。但隨著養(yǎng)殖方式的改進,養(yǎng)殖密度的增加的同時,花鱸病害問題也頻繁發(fā)生。因此,通過研究花鱸的抗病免疫機制,探尋增強花鱸抗菌能力的途徑和方法,為養(yǎng)殖中的病害診治提供理論支持愈加重要。先天免疫系統(tǒng)是普遍存在于各類機體中的重要防御機制,其主要通過免疫細胞表面的模式識別受體識別病原生物表面的病原體相關(guān)分子模式來啟動。作為模式識別受體的重要成員,Toll樣受體可識別多種病原生物,并能連接先天性免疫和特異性免疫系統(tǒng)。TRAF6和IRAK4是Toll樣受體家族信號通路中的重要接頭分子,它們通過與MyD88和IRAK1等形成復合物將免疫信號傳遞到下游NF-κB,引起系列促炎細胞因子的表達,引起機體免疫反應(yīng)。基于Toll信號通路對細菌的識別功能,以及TRAF6和IRAK4在Toll樣通路的信號傳遞作用,本研究克隆了L.maculates的LmTRAF6和LmIRAK4基因序列,并分析了其序列特征、亞細胞定位、各組織含量以及菌應(yīng)激下的表達模式。為進一步探索LmTRAF6參與抵抗細菌侵害的作用及方式,本研究檢測了過表達LmTRAF6的HEK293T細胞在菌刺激下的凋亡率,以及此時細胞內(nèi)NF-κB活性的變化。此外,本研究利用花鱸頭腎原代培養(yǎng)細胞開展了LmTRAF6過表達實驗及siRNA干擾實驗,初步建立了以花鱸細胞為載體的基因研究平臺,為深入研究花鱸基因結(jié)構(gòu)功能、表達規(guī)律及其上下游因子提供了基礎(chǔ)。LmTRAF6基因cDNA ORF全長1707 bp,編碼568個氨基酸,理論分子量約64.01 kDa,理論等電點是6.01。結(jié)構(gòu)域分析表明,LmTRAF6氨基酸序列含有1個N端環(huán)指結(jié)構(gòu)(80~119 aa)、2個鋅指結(jié)構(gòu)域(161~202 aa,214~268 aa)、1個環(huán)-環(huán)α螺旋結(jié)構(gòu)(355~395 aa)和C端的TRAF同源結(jié)構(gòu)域(394~541 aa)。其不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽。多重序列比對結(jié)果表明LmTRAF6與其他物種LmTRAF6序列高度保守,與條石鯛TRAF6相似度最高(93%)。亞細胞定位結(jié)果表明其主要分布于HEK293T細胞的細胞質(zhì)中。各組織定量分析表明LmTRAF6在多個組織中均有表達,在鰓中表達量最高,其次是腦、腸和脾臟。體內(nèi)菌刺激實驗結(jié)果表明,經(jīng)Vibrio harveyi和Streptococcus agalactiae應(yīng)激后,LmTRAF6在脾臟、頭腎和肝臟中表達顯著升高,說明LmTRAF6與花鱸的抗菌機制有關(guān),參與了機體的免疫反應(yīng)。為了進一步證明LmTRAF6可參與抗菌免疫反應(yīng),基于HEK293T免疫模型,檢測了過表達LmTRAF6的HEK293T細胞分別在V.harveyi和S.agalactiae刺激下的凋亡率。結(jié)果顯示,在兩種菌刺激下,轉(zhuǎn)染LmTRAF6的細胞系活細胞數(shù)量較對照組分別提高了18.85%和5.4%。說明LmTRAF6可在一定程度上提高細胞抵抗菌刺激的免疫能力。為了驗證LmTRAF6可通過激活NF-κB增強細胞抵抗V.harveyi和S.agalactiae的免疫能力,本研究采用雙熒光素報告系統(tǒng)檢測了LmTRAF6對HEK293T內(nèi)NF-κB的激活效果。結(jié)果表明:HEK293T在轉(zhuǎn)染LmTRAF6后NF-κB活性顯著升高;當HEK293T在面對V.harveyi和S.agalactiae刺激時,轉(zhuǎn)染LmTRAF6可進一步提高NF-κB活性,且細胞存活率升高。說明LmTRAF6可能是通過激活NF-κB來調(diào)控免疫因子的表達,以參與到細胞抵抗細菌的免疫過程中。功能域是蛋白質(zhì)行使功能的主要部位,為了研究LmTRAF6活化NF-κB的主要依賴功能域,本研究采用雙熒光素報告系統(tǒng)檢測了功能域缺失的LmTRAF6對NF-κB的激活效果。結(jié)果表明:缺少環(huán)指結(jié)構(gòu)域或鋅指結(jié)構(gòu)域,會抑制LmTRAF6對NF-κB的激活作用;而缺失MATH結(jié)構(gòu)域則對LmTRAF6活化NF-κB沒有明顯的影響。說明環(huán)指結(jié)構(gòu)域或鋅指結(jié)構(gòu)域是LmTRAF6向下傳遞信號的關(guān)鍵功能域。LmIRAK4基因cDNA ORF全長942bp,編碼313個氨基酸,理論分子量約34.97kDa,理論等電點是5.65。結(jié)構(gòu)域分析表明,LmIRAK4含有1個N端死亡結(jié)構(gòu)域(8~104 aa)和1個中央蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(185~312 aa)。推導的LmIRAK4氨基酸序列與其他魚類IRAK4氨基酸序列具有高度一致性,與條石鯛IRAK4相似度最高(84%)。亞細胞定位顯示,LmIRAK4在HEK-293T細胞成功表達,且主要分布于胞質(zhì)中。組織分布結(jié)果表明LmIRAK4在各組織中表達具差異性,在頭腎中表達量最高,其次為鰓和肝臟。感染無乳鏈球菌與哈維弧菌后,花鱸頭腎、肝臟和脾中LmIRAK4 mRNA的表達水平顯著升高,說明LmIRAK4參與了花鱸的免疫反應(yīng)。為了建立以花鱸細胞為載體的基因研究平臺,本研究培養(yǎng)了花鱸頭腎原代細胞,并進行了LmTRAF6過表達及干擾實驗。結(jié)果表明:外源性LmTRAF6表達成功,但表達量較少,需進一步探索啟動子等相關(guān)因素;內(nèi)源性LmTRAF6被siRNA成功干擾,表達量下降至30%。該實驗為深入研究花鱸基因結(jié)構(gòu)功能、表達規(guī)律及其上下游因子提供了初步的基礎(chǔ)平臺。
【圖文】：

圖 1-1 魚類 TLRs 信號通路Fig 1-1 The signaling pathway of fish TLRs白色部分表示正調(diào)控因子；灰色部分表示負調(diào)控因子。The white means positive regulatory factors; Negative regulatory factors are highlighted with grey. 信號通路的關(guān)鍵因子 TRAF6 及 IRAK4AF6 結(jié)構(gòu)與功能所述，TRAF6 是 TLR 信號通路內(nèi)的重要接頭蛋白，其所在的家子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptor-associated factorsAFs 家族成員分布廣泛，，是一類多功能蛋白。它們作為胞內(nèi)接頭疫受體家族的信號傳導，它們不但能夠在 IL-1/TLR 家族信號通能直接與腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族結(jié)、DR3、TRAIL-R2、CD40、Ox40 和 TACI 等 29 種 TNF 成員[62

24圖 2-4 LmIRAK4 的核酸和氨基酸序列Fig. 2-4 The nucleotide and deduced amino acid sequences of LmIRAK4.兩邊每行標注的序號指核苷酸和氨基酸的位置：起始密碼子（ATG）和終止密碼子（TGA）用方框標出；單下劃線標注為 N端死亡結(jié)構(gòu)域序列；雙下劃線標注為中央蛋白激酶結(jié)構(gòu)域序列。The initiation code (ATG) and the termination code (TGA) are boxed. The N-terminal death domain is underlined, and C-terminalprotein kinases domain site is double underlined.
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S943

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本文編號：2613590