【摘要】：花鱸(Lateolabrax maculatus)為廣鹽性海水魚,易養(yǎng)殖,經(jīng)濟(jì)效益高,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類。但隨著養(yǎng)殖方式的改進(jìn),養(yǎng)殖密度的增加的同時(shí),花鱸病害問題也頻繁發(fā)生。因此,通過研究花鱸的抗病免疫機(jī)制,探尋增強(qiáng)花鱸抗菌能力的途徑和方法,為養(yǎng)殖中的病害診治提供理論支持愈加重要。先天免疫系統(tǒng)是普遍存在于各類機(jī)體中的重要防御機(jī)制,其主要通過免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體識(shí)別病原生物表面的病原體相關(guān)分子模式來啟動(dòng)。作為模式識(shí)別受體的重要成員,Toll樣受體可識(shí)別多種病原生物,并能連接先天性免疫和特異性免疫系統(tǒng)。TRAF6和IRAK4是Toll樣受體家族信號(hào)通路中的重要接頭分子,它們通過與MyD88和IRAK1等形成復(fù)合物將免疫信號(hào)傳遞到下游NF-κB,引起系列促炎細(xì)胞因子的表達(dá),引起機(jī)體免疫反應(yīng)�；赥oll信號(hào)通路對(duì)細(xì)菌的識(shí)別功能,以及TRAF6和IRAK4在Toll樣通路的信號(hào)傳遞作用,本研究克隆了L.maculates的LmTRAF6和LmIRAK4基因序列,并分析了其序列特征、亞細(xì)胞定位、各組織含量以及菌應(yīng)激下的表達(dá)模式。為進(jìn)一步探索LmTRAF6參與抵抗細(xì)菌侵害的作用及方式,本研究檢測(cè)了過表達(dá)LmTRAF6的HEK293T細(xì)胞在菌刺激下的凋亡率,以及此時(shí)細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性的變化。此外,本研究利用花鱸頭腎原代培養(yǎng)細(xì)胞開展了LmTRAF6過表達(dá)實(shí)驗(yàn)及siRNA干擾實(shí)驗(yàn),初步建立了以花鱸細(xì)胞為載體的基因研究平臺(tái),為深入研究花鱸基因結(jié)構(gòu)功能、表達(dá)規(guī)律及其上下游因子提供了基礎(chǔ)。LmTRAF6基因cDNA ORF全長(zhǎng)1707 bp,編碼568個(gè)氨基酸,理論分子量約64.01 kDa,理論等電點(diǎn)是6.01。結(jié)構(gòu)域分析表明,LmTRAF6氨基酸序列含有1個(gè)N端環(huán)指結(jié)構(gòu)(80~119 aa)、2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(161~202 aa,214~268 aa)、1個(gè)環(huán)-環(huán)α螺旋結(jié)構(gòu)(355~395 aa)和C端的TRAF同源結(jié)構(gòu)域(394~541 aa)。其不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。多重序列比對(duì)結(jié)果表明LmTRAF6與其他物種LmTRAF6序列高度保守,與條石鯛TRAF6相似度最高(93%)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明其主要分布于HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。各組織定量分析表明LmTRAF6在多個(gè)組織中均有表達(dá),在鰓中表達(dá)量最高,其次是腦、腸和脾臟。體內(nèi)菌刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)Vibrio harveyi和Streptococcus agalactiae應(yīng)激后,LmTRAF6在脾臟、頭腎和肝臟中表達(dá)顯著升高,說明LmTRAF6與花鱸的抗菌機(jī)制有關(guān),參與了機(jī)體的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步證明LmTRAF6可參與抗菌免疫反應(yīng),基于HEK293T免疫模型,檢測(cè)了過表達(dá)LmTRAF6的HEK293T細(xì)胞分別在V.harveyi和S.agalactiae刺激下的凋亡率。結(jié)果顯示,在兩種菌刺激下,轉(zhuǎn)染LmTRAF6的細(xì)胞系活細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組分別提高了18.85%和5.4%。說明LmTRAF6可在一定程度上提高細(xì)胞抵抗菌刺激的免疫能力。為了驗(yàn)證LmTRAF6可通過激活NF-κB增強(qiáng)細(xì)胞抵抗V.harveyi和S.agalactiae的免疫能力,本研究采用雙熒光素報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)了LmTRAF6對(duì)HEK293T內(nèi)NF-κB的激活效果。結(jié)果表明:HEK293T在轉(zhuǎn)染LmTRAF6后NF-κB活性顯著升高;當(dāng)HEK293T在面對(duì)V.harveyi和S.agalactiae刺激時(shí),轉(zhuǎn)染LmTRAF6可進(jìn)一步提高NF-κB活性,且細(xì)胞存活率升高。說明LmTRAF6可能是通過激活NF-κB來調(diào)控免疫因子的表達(dá),以參與到細(xì)胞抵抗細(xì)菌的免疫過程中。功能域是蛋白質(zhì)行使功能的主要部位,為了研究LmTRAF6活化NF-κB的主要依賴功能域,本研究采用雙熒光素報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)了功能域缺失的LmTRAF6對(duì)NF-κB的激活效果。結(jié)果表明:缺少環(huán)指結(jié)構(gòu)域或鋅指結(jié)構(gòu)域,會(huì)抑制LmTRAF6對(duì)NF-κB的激活作用;而缺失MATH結(jié)構(gòu)域則對(duì)LmTRAF6活化NF-κB沒有明顯的影響。說明環(huán)指結(jié)構(gòu)域或鋅指結(jié)構(gòu)域是LmTRAF6向下傳遞信號(hào)的關(guān)鍵功能域。LmIRAK4基因cDNA ORF全長(zhǎng)942bp,編碼313個(gè)氨基酸,理論分子量約34.97kDa,理論等電點(diǎn)是5.65。結(jié)構(gòu)域分析表明,LmIRAK4含有1個(gè)N端死亡結(jié)構(gòu)域(8~104 aa)和1個(gè)中央蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(185~312 aa)。推導(dǎo)的LmIRAK4氨基酸序列與其他魚類IRAK4氨基酸序列具有高度一致性,與條石鯛I(yíng)RAK4相似度最高(84%)。亞細(xì)胞定位顯示,LmIRAK4在HEK-293T細(xì)胞成功表達(dá),且主要分布于胞質(zhì)中。組織分布結(jié)果表明LmIRAK4在各組織中表達(dá)具差異性,在頭腎中表達(dá)量最高,其次為鰓和肝臟。感染無乳鏈球菌與哈維弧菌后,花鱸頭腎、肝臟和脾中LmIRAK4 mRNA的表達(dá)水平顯著升高,說明LmIRAK4參與了花鱸的免疫反應(yīng)。為了建立以花鱸細(xì)胞為載體的基因研究平臺(tái),本研究培養(yǎng)了花鱸頭腎原代細(xì)胞,并進(jìn)行了LmTRAF6過表達(dá)及干擾實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:外源性LmTRAF6表達(dá)成功,但表達(dá)量較少,需進(jìn)一步探索啟動(dòng)子等相關(guān)因素;內(nèi)源性LmTRAF6被siRNA成功干擾,表達(dá)量下降至30%。該實(shí)驗(yàn)為深入研究花鱸基因結(jié)構(gòu)功能、表達(dá)規(guī)律及其上下游因子提供了初步的基礎(chǔ)平臺(tái)。
【圖文】：

圖 1-1 魚類 TLRs 信號(hào)通路Fig 1-1 The signaling pathway of fish TLRs白色部分表示正調(diào)控因子；灰色部分表示負(fù)調(diào)控因子。The white means positive regulatory factors; Negative regulatory factors are highlighted with grey. 信號(hào)通路的關(guān)鍵因子 TRAF6 及 IRAK4AF6 結(jié)構(gòu)與功能所述，TRAF6 是 TLR 信號(hào)通路內(nèi)的重要接頭蛋白，其所在的家子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptor-associated factorsAFs 家族成員分布廣泛，，是一類多功能蛋白。它們作為胞內(nèi)接頭疫受體家族的信號(hào)傳導(dǎo)，它們不但能夠在 IL-1/TLR 家族信號(hào)通能直接與腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族結(jié)、DR3、TRAIL-R2、CD40、Ox40 和 TACI 等 29 種 TNF 成員[62

24圖 2-4 LmIRAK4 的核酸和氨基酸序列Fig. 2-4 The nucleotide and deduced amino acid sequences of LmIRAK4.兩邊每行標(biāo)注的序號(hào)指核苷酸和氨基酸的位置：起始密碼子（ATG）和終止密碼子（TGA）用方框標(biāo)出；單下劃線標(biāo)注為 N端死亡結(jié)構(gòu)域序列；雙下劃線標(biāo)注為中央蛋白激酶結(jié)構(gòu)域序列。The initiation code (ATG) and the termination code (TGA) are boxed. The N-terminal death domain is underlined, and C-terminalprotein kinases domain site is double underlined.
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S943

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本文編號(hào)：2613590