【摘要】：【目的】克隆蘋果細胞分裂素響應因子基因Md CRF6(cytokinin response factor 6),鑒定其在調節(jié)花青苷積累和鹽脅迫抗性中的作用,揭示Md CRF6的功能,為研究細胞分裂素信號途徑和果樹生長發(fā)育調控提供理論依據(jù)。【方法】以‘嘎啦’蘋果(Malus domestica‘Gala’)為研究材料,利用同源序列比對和PCR技術,分離細胞分裂素響應基因Md CRF6。使用MEGA 5.0軟件構建蘋果Md CRF6與擬南芥CRFs間系統(tǒng)進化樹;通過SMART軟件和DNAMAN軟件分析Md CRF6蛋白的保守結構域。利用實時熒光定量PCR方法檢測該基因對細胞分裂素和鹽脅迫的響應。通過電泳遷移率試驗(EMSA),驗證Md CRF6原核表達蛋白對DRE作用元件的綁定。構建Md CRF6植物超表達載體,并通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化獲得轉Md CRF6蘋果愈傷組織。比較野生型和轉基因蘋果愈傷組織在花青苷積累和鹽抗性方面的差異,結合基因表達分析,初步鑒定Md CRF6在調節(jié)花青苷積累和鹽脅迫方面的生物學功能�！窘Y果】分離得到了蘋果細胞分裂素響應因子基因Md CRF6(基因序列號:MDP0000783818),該基因開放閱讀框(ORF)為1 047 bp,編碼含有348個氨基酸的蛋白。進化樹分析和氨基酸序列比對結果表明,蘋果Md CRF6蛋白在N端包含保守的CRF結構域,在C端包含保守的AP2/ERF結構域,并且與擬南芥At CRF6同源性最高�；虮磉_分析顯示該基因具有細胞分裂素和鹽脅迫響應,分別在10μmol·L-1 BA和100 mmol·L-1 Na Cl處理3 h和6 h時表達量最高。EMSA試驗結果驗證Md CRF6原核表達蛋白能夠綁定DRE序列。在蘋果愈傷組織中超表達Md CRF6,發(fā)現(xiàn)Md CRF6轉基因蘋果愈傷組織花青苷積累受到抑制,同時蘋果愈傷組織的抗鹽性降低�；虮磉_分析顯示,Md CRF6顯著抑制花青苷合成基因和鹽響應相關基因的表達。【結論】蘋果Md CRF6與擬南芥At CRF6具有高度的同源性,其參與植物對細胞分裂素和鹽脅迫的響應。在蘋果愈傷組織中超量表達Md CRF6抑制其花青苷積累,降低植物抗鹽性。推測蘋果Md CRF6可能通過結合花青苷合成基因以及抗鹽相關基因的啟動子,抑制基因的表達,從而負調節(jié)花青苷積累和抗鹽性。
【圖文】：

苷含量。計算公式：OD=（A530-A620）-0.1×(A650-A620)。1.7蘋果愈傷組織鹽脅迫試驗選擇生長狀態(tài)一致的野生型（WT）和轉基因（MdCRF6-L1和MdCRF6-L2）蘋果愈傷組織進行鹽脅迫試驗。將大小一致的愈傷放置到含有不同NaCl濃度的繼代培養(yǎng)基上。常溫、暗處培養(yǎng)15d，觀察并稱量愈傷組織的質量。1.8統(tǒng)計學分析使用R（3.0.2）軟件進行統(tǒng)計學分析。所有結果都是基于3個平行試驗的平均值。2結果2.1蘋果MdCRF6的克隆及同源性分析以‘嘎啦’幼苗的cDNA為模板，MdCRF6-F/R為引物進行PCR擴增，獲得一條大約1000bp的條帶（圖1）。對克隆得到的片段測序分析，結果表明，，該基因片段的開放閱讀框（ORF）長度為1047bp，編碼含有348個氨基酸的蛋白質，命名為MdCRF6（MDP0000783818）。圖1蘋果MdCRF6的RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳Fig.1ElectrophoresisofRT-PCRproductsforMdCRF6cloning將蘋果MdCRF6氨基酸序列與擬南芥中12個細胞分裂素響應因子基因（AtCRF1—AtARF12）的氨基酸序列進行比對并構建進化樹（圖2）。進化樹分析結果表明，蘋果MdCRF6與擬南芥AtCRF6親緣關系最近，同源性最高。AtCRF6AT3G61630.1MdCRF6MDP0000783818AtCRF11AT3G25890.1AtCRF3AT5G53290.1AtCRF10AT1G68550.1AtCRF3AT4G23750.1AtCRF4AT4G27950.1AtCRF1AT4G11140.1AtCRF9AT1G49120.1AtCRF5AT2G46310.1AtCRF12AT1G25470.1AtCRF1AT1G22985.10.05AtCRF1AT1G71130.1At：擬南芥Arabidopsisthaliana；Md：蘋果Malusdomestica圖2蘋果MdCRF6與擬南芥CRFs的進化樹分析Fig.2PhylogenetictreeanalysisofMdCRF6withCRFsfromArabidopsis對蘋果MdCRF6的氨基酸序列進行分析（圖3）。結果顯示，MdCRF6僅包含一個外顯子，無內含子。MdCRF6蛋白在N端包含一個保守的CRF結

薈CGAC）序列突變?yōu)?CCGGAG-，結合條帶消失（圖5）。2.4載體構建與轉基因蘋果愈傷組織鑒定構建MdCRF6超表達載體MdCRF6-pCAMBIA1300（圖6），轉化農(nóng)桿菌LBA4404，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化侵染蘋果愈傷組織。實時熒光定量PCR檢測轉基因株系MdCRF6表達量（圖7）。獲得L1和L2兩個轉基因株系。ARR6啟動子序列pARR6:-GCAAGATTTAACCGACCCAAACCGAT-ARR6啟動子突變序列pARR6(Mut):-GCAAGATTTACCGGAGCCAAACCGAT-5×10×Mut自由探針Free-Probe結合探針Bound-ProbeCompetitorBiotin-ProbeGST-MdCRF6GST圖5MdCRF6綁定DRE序列Fig.5MdCRF6bindstoDREmotif

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