【摘要】：植物病毒是一類重要的植物病原,對(duì)農(nóng)作物造成嚴(yán)重危害,導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失。病毒在侵染過(guò)程中,植物體內(nèi)的多種抗性途徑也會(huì)發(fā)揮作用,抑制病毒的侵染,減輕病害的嚴(yán)重程度。進(jìn)一步發(fā)掘植物體內(nèi)參與抗性途徑的生物大分子對(duì)于了解病毒-植物相互作用、提出新型抗病策略具有重要意義。在前期對(duì)馬鈴薯X病毒(Potato Virus X,PVX)和蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)侵染本氏煙(Nicotiana Benthamiana)小RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)病毒侵染導(dǎo)致本氏煙AGD2-like defense response protein 1基因(NbALD1)和miR166h-p5(nbe-miR166h-p5)的上調(diào)表達(dá),我們對(duì)該基因和miRNA在病毒侵染過(guò)程中的功能展開(kāi)了深入研究。ALD1編碼一種氨基轉(zhuǎn)移酶,在哌啶酸(pipecolic acid,Pip)合成過(guò)程中起重要作用。有研究表明,哌啶酸是植物系統(tǒng)獲得抗性的關(guān)鍵因子;ald1突變體植株相比野生型植株更易感染P.s.tomato DC3000;表達(dá)ALD1的擬南芥植株對(duì)Ps.tomato DC3000抗性增強(qiáng);同時(shí),表達(dá)ALD1的水稻植株對(duì)稻瘟病菌的抗病性也增強(qiáng)。但是,ALD1在病毒侵染過(guò)程中的功能尚不清楚。本研究中,qRT-PCR證實(shí)NbALD1在TuMV侵染植株體內(nèi)上調(diào)表達(dá);利用煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)誘導(dǎo)的沉默系統(tǒng)沉默NbALD1未對(duì)植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育造成顯著影響;在NbALD1沉默植株上接種TuMV-GFP,發(fā)現(xiàn)接種葉上熒光斑點(diǎn)數(shù)量顯著增加,病毒的積累量也顯著增加,并且病毒系統(tǒng)侵染率明顯加快;外源施加哌啶酸會(huì)提高野生型和NbALD1沉默植株對(duì)TuMV的抗病性。沉默NbALD1后分別接種PVX和煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),也得到相同的結(jié)果,這表明NbALD1沉默有利于TuMV、PVX和TMV的侵染。進(jìn)一步研究結(jié)果表明,NbALD1沉默會(huì)降低植株體內(nèi)水楊酸的含量和水楊酸信號(hào)途徑下游基因NPR1的表達(dá)量;外源施加哌啶酸也會(huì)在一定程度上提高轉(zhuǎn)NahG植株對(duì)病毒的抗病性,但不能完全恢復(fù)抗性,暗示著沉默NbALD1引起的對(duì)植株的易感性不僅僅是依賴水楊酸途徑下調(diào)導(dǎo)致,可能還有其他途徑參與其中。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),沉默NbALD1提高了植株體內(nèi)乙烯前體的含量。而沉默乙烯途徑關(guān)鍵基因ACS1、ACO1、EIN2增強(qiáng)了植株對(duì)TuMV的抗性;同時(shí),外源施加乙烯前體ACC促進(jìn)了TuMV的侵染。因此,我們推測(cè)NbALD1沉默可能導(dǎo)致乙烯途徑的上調(diào)提高對(duì)TuMV的易感性。這些結(jié)果說(shuō)明NbALD1除了正向調(diào)控SA途徑參與抗性過(guò)程之外,還負(fù)向調(diào)控乙烯途徑參與了抗病毒侵染過(guò)程。越來(lái)越多的研究表明,miRNA在病毒侵染過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。我們分析PVX侵染后本氏煙miRNA表達(dá)譜變化發(fā)現(xiàn),nbe-MIR166h前體上5'端產(chǎn)生的nbe-miR166h-p5積累量增加,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),nbe-miR1166h-p5的沉默導(dǎo)致植株葉片濃綠;在沉默nbe-miR166h-p5的植株上接種PVX后,PVX侵染所引起的黃化癥狀明顯減弱,葉綠素含量的下降也有一定程度的緩解;并伴隨著PVX積累量大量減少。在TuMV和辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mosaic virus,PMMoV)侵染的植株中nbe-miR166h-p5的轉(zhuǎn)錄水平也有顯著提高。沉默nbe-miR166h-p5后也會(huì)減輕TuMV和PMMoV侵染后所引起的黃化癥狀、葉綠素含量的降低,并且降低了病毒的積累量。同時(shí),我們預(yù)測(cè)了 nbe-miR166h-p5的三個(gè)靶基因,并進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明nbe-miR166h-p5與PVX等病毒侵染產(chǎn)生的癥狀相關(guān),并可能參與了植物抗病毒過(guò)程。綜上所述,本研究揭示了NbALD 通過(guò)正向調(diào)控SA途徑,負(fù)向調(diào)控乙烯途徑參與了植物抗病毒侵染過(guò)程;nbe-miR166h-p5通過(guò)其表達(dá)水平變化參與了植物病毒的癥狀表現(xiàn),并可能參與植物抗病毒過(guò)程。這些研究對(duì)深入了解寄主組分是如何參與抗病的過(guò)程有重要的價(jià)值。
【圖文】：

４３邋科丨５６邋屬的邋３１８邋種植物（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ邋ｅｔａｌ．，邋１９８８；邋Ｗａｌｓｈ邋ｅｔａｌ．，邋２００２），嚴(yán)重威脅農(nóng)逡逑作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶了了巨大的損失。ＴｕＭＶ可由８０多種蚜蟲(chóng)以逡逑非持久性方式傳播，其侵染的植株初期表現(xiàn)為葉片褪綠、花葉、皺縮，后期表現(xiàn)逡逑為植株畸形、矮化、生育推遲甚至嚴(yán)重時(shí)植株出現(xiàn)死亡等現(xiàn)象。逡逑１．３．２邋ＴｕＭＶ的分子生物學(xué)特點(diǎn)逡逑ＴｕＭＶ基因組由一條單組份正義鏈單鏈ＲＮＡ分子組成，長(zhǎng)約９７９８？９８４４個(gè)逡逑核苷酸，編碼一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框（Ｏｐｅｎ邋ｒｅａｄｉｎｇ邋ｆｒａｍｅ，邋ＯＲＦ），這一開(kāi)放閱讀框逡逑被表達(dá)成一個(gè)多肽前體，，隨后在自身編碼的蛋白酶（ＰＩ，邋ＨＣ－Ｐｒｏ，邋ＮＩａ－Ｐｒｏ）的參與下逡逑形成１０個(gè)結(jié)構(gòu)和功能不同的成熟蛋白Ｐ］、ＨＣ－Ｐｒｏ、Ｐ３、６Ｋ１、ＣＩ、６Ｋ２、ＶＰｇ、逡逑ＮＩａ－Ｐｒｏ、Ｎｉｂ－Ｐｒｏ和ＣＰ蛋白（圖１．３）。而Ｃｈｕｎｇ于２００８年發(fā)現(xiàn)Ｐ３蛋白編碼區(qū)內(nèi)逡逑部存在一個(gè)較小的ＯＲＦ，它通過(guò)核糖體移碼策略翻譯形成Ｐ３Ｎ－ＰＩＰＯ蛋白，并且逡逑已經(jīng)通過(guò)免疫印跡雜交證實(shí)了邋Ｐ３Ｎ－ＰＩＰＯ確實(shí)存在于受侵染的植株中。逡逑▲邋一邐邋＋２邋ｆｒａｍｅ逡逑

圖２．１邋Ｎｏｒｔｈｅｒｎ邋ｂｌｏｔ轉(zhuǎn)膜不意圖逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ｄｉａｇｒａｍｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａ邋ｃａｐｉｌｌａｒｙ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋ａｐｐａｒａｒｔｕｓ逡逑固定：轉(zhuǎn)膜完成后，用２ｘＳＳＣ溶液漂洗尼龍膜５邋ｍｉｎ，用濾紙吸干水分，紙內(nèi)固定好，８０°Ｃ高溫固定２邋ｈ。固定后可進(jìn)行預(yù)雜交或放于４°Ｃ短時(shí)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S432.41

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本文編號(hào)：2594375