【摘要】：油體鈣蛋白因其具有EF-手型結(jié)構(gòu)域被歸類為鈣離子調(diào)節(jié)蛋白,它在植物發(fā)展過程及應(yīng)激反應(yīng)中扮演著非常重要的角色。在目前的研究中,研究者發(fā)現(xiàn)caleosin能夠參與單層磷脂層和油體的錨定結(jié)合,在增加種子油體的穩(wěn)定性上起著至關(guān)重要的作用。油體鈣蛋白N-端結(jié)構(gòu)域含有EF-Hand結(jié)構(gòu),可以結(jié)合1個Ca~(2+),C-端結(jié)構(gòu)域含有磷酸化位點(diǎn),推測caleosin可能參與由鈣離子調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,并且與植物耐受干旱脅迫存在必然的聯(lián)系。本研究從吉育72號大豆中克隆了Gmpm13基因并對其在田間實(shí)驗(yàn)材料、干旱脅迫及原核生物中的表達(dá)進(jìn)行了初步的分析,為大豆caleosin蛋白在植物基因工程、生物技術(shù)及生物化學(xué)上的應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù),主要結(jié)果如下:1、通過RT-PCR法克隆了大豆Gmpm13基因,獲得一個全長為885bp的cDNA序列,包括一個720bp的開放閱讀框,編碼239個氨基酸;并通過在線軟件對基因序列進(jìn)行分析,確定Gmpm13基因分布在10號染色體上,理論等電點(diǎn)為5.15,沒有同源基因和信號肽,在59-228個氨基酸處有一個EF-手型結(jié)構(gòu)域、在63-92個氨基酸處有一個caleosin結(jié)構(gòu)域,在92-115個氨基酸處有一個跨膜區(qū)。通過設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)的引物克隆得到全長為738bp的油體鈣蛋白基因,它編碼的蛋白大小為27.1kDa,并與原核表達(dá)載體pET-28a連接,命名為pET-28a-pm13,并對其原核表達(dá)體系進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明在28℃,1.5mmol/L IPTG濃度下誘導(dǎo)12 h達(dá)到蛋白的最大表達(dá)量,占總蛋白的39.25%。2、通過實(shí)時熒光定量PCR的方法對田間實(shí)驗(yàn)材料不同生育時期(苗期、分枝期、開花期、結(jié)莢鼓粒期、成熟期)、不同器官(根、葉片和種子)Gmpm13基因相對表達(dá)水平進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)隨著生育時期的變化,根和葉片中基因的表達(dá)水平呈先升后降趨勢,在結(jié)莢鼓粒期最高分別為0.0631和0.3294;種子中基因表達(dá)水平逐漸增加,完熟期達(dá)到最高值0.0378。采用紫外分光光度法對游離氨基酸、可溶性蛋白含量進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)隨著生育時期的變化,游離氨基酸含量在根和葉片中呈先升后降趨勢,在結(jié)莢鼓粒期達(dá)到最高,分別為38.3867μg/g和19.4143μg/g;可溶性蛋白含量變化趨勢與游離氨基酸相同,最高值分別為0.0358mg/g和0.0524mg/g;在種子中可溶性蛋白含量逐漸升高,完熟期達(dá)到最高0.8763mg/g,游離氨基酸含量先升高后降低,最高值為54.3827μg/g。3、對干旱脅迫處理的(PEG6000的濃度分別為0、5%、10%、15%、20%、25%,分別脅迫1-6天)苗期大豆葉片Gmpm13基因的相對表達(dá)水平進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)隨著脅迫時間和濃度的增加,基因表達(dá)水平呈先增后降趨勢,在PEG6000濃度為20%脅迫4天時達(dá)到最高值17.248。采用比色法和紫外分光光度法檢測抗氧化酶(SDO、POD、CAT)活性和膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)含量,發(fā)現(xiàn)隨著脅迫時間和濃度的增加,POD、CAT和SOD活性呈先升后降趨勢,SOD和POD活性在脅迫濃度為15%脅迫3天時達(dá)到最高值,分別為7329.62u/mg(蛋白)和2191.43u/(g·min),CAT活性在脅迫濃度為15%脅迫4天時達(dá)到最高值148.347u/(g·min);MDA含量逐漸升高,在脅迫濃度為25%脅迫6天時達(dá)到最高值116.775μmol/g;采用磺基水楊酸法對滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(Pro)的含量進(jìn)行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pro含量隨時間增加逐漸增加,隨濃度的增加呈先增后降趨勢,在脅迫濃度為15%脅迫6天時達(dá)到最高值316.602ug/g。
【圖文】：

電泳檢測大豆種子總 of total RNA in soybean0 Marker; 1: 總 RNA; 1:，并以此為模板進(jìn)行，與預(yù)測片段大小一M 1 2000000p.2 PCR 擴(kuò)增 Gmpm13PCR amplification of Gm1、2：均為 PCR 產(chǎn)物

5002 0001 000750250100M 1bp2.1 電泳檢測大豆種子tion of total RNA in soyb000 Marker; 1: 總 RNAA，并以此為模板進(jìn)），與預(yù)測片段大小M 1 2
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S565.1;Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2592742