【摘要】：油體鈣蛋白因其具有EF-手型結(jié)構(gòu)域被歸類(lèi)為鈣離子調(diào)節(jié)蛋白,它在植物發(fā)展過(guò)程及應(yīng)激反應(yīng)中扮演著非常重要的角色。在目前的研究中,研究者發(fā)現(xiàn)caleosin能夠參與單層磷脂層和油體的錨定結(jié)合,在增加種子油體的穩(wěn)定性上起著至關(guān)重要的作用。油體鈣蛋白N-端結(jié)構(gòu)域含有EF-Hand結(jié)構(gòu),可以結(jié)合1個(gè)Ca~(2+),C-端結(jié)構(gòu)域含有磷酸化位點(diǎn),推測(cè)caleosin可能參與由鈣離子調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,并且與植物耐受干旱脅迫存在必然的聯(lián)系。本研究從吉育72號(hào)大豆中克隆了Gmpm13基因并對(duì)其在田間實(shí)驗(yàn)材料、干旱脅迫及原核生物中的表達(dá)進(jìn)行了初步的分析,為大豆caleosin蛋白在植物基因工程、生物技術(shù)及生物化學(xué)上的應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù),主要結(jié)果如下:1、通過(guò)RT-PCR法克隆了大豆Gmpm13基因,獲得一個(gè)全長(zhǎng)為885bp的cDNA序列,包括一個(gè)720bp的開(kāi)放閱讀框,編碼239個(gè)氨基酸;并通過(guò)在線軟件對(duì)基因序列進(jìn)行分析,確定Gmpm13基因分布在10號(hào)染色體上,理論等電點(diǎn)為5.15,沒(méi)有同源基因和信號(hào)肽,在59-228個(gè)氨基酸處有一個(gè)EF-手型結(jié)構(gòu)域、在63-92個(gè)氨基酸處有一個(gè)caleosin結(jié)構(gòu)域,在92-115個(gè)氨基酸處有一個(gè)跨膜區(qū)。通過(guò)設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物克隆得到全長(zhǎng)為738bp的油體鈣蛋白基因,它編碼的蛋白大小為27.1kDa,并與原核表達(dá)載體pET-28a連接,命名為pET-28a-pm13,并對(duì)其原核表達(dá)體系進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明在28℃,1.5mmol/L IPTG濃度下誘導(dǎo)12 h達(dá)到蛋白的最大表達(dá)量,占總蛋白的39.25%。2、通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)田間實(shí)驗(yàn)材料不同生育時(shí)期(苗期、分枝期、開(kāi)花期、結(jié)莢鼓粒期、成熟期)、不同器官(根、葉片和種子)Gmpm13基因相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)隨著生育時(shí)期的變化,根和葉片中基因的表達(dá)水平呈先升后降趨勢(shì),在結(jié)莢鼓粒期最高分別為0.0631和0.3294;種子中基因表達(dá)水平逐漸增加,完熟期達(dá)到最高值0.0378。采用紫外分光光度法對(duì)游離氨基酸、可溶性蛋白含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)隨著生育時(shí)期的變化,游離氨基酸含量在根和葉片中呈先升后降趨勢(shì),在結(jié)莢鼓粒期達(dá)到最高,分別為38.3867μg/g和19.4143μg/g;可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)與游離氨基酸相同,最高值分別為0.0358mg/g和0.0524mg/g;在種子中可溶性蛋白含量逐漸升高,完熟期達(dá)到最高0.8763mg/g,游離氨基酸含量先升高后降低,最高值為54.3827μg/g。3、對(duì)干旱脅迫處理的(PEG6000的濃度分別為0、5%、10%、15%、20%、25%,分別脅迫1-6天)苗期大豆葉片Gmpm13基因的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)隨著脅迫時(shí)間和濃度的增加,基因表達(dá)水平呈先增后降趨勢(shì),在PEG6000濃度為20%脅迫4天時(shí)達(dá)到最高值17.248。采用比色法和紫外分光光度法檢測(cè)抗氧化酶(SDO、POD、CAT)活性和膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(MDA)含量,發(fā)現(xiàn)隨著脅迫時(shí)間和濃度的增加,POD、CAT和SOD活性呈先升后降趨勢(shì),SOD和POD活性在脅迫濃度為15%脅迫3天時(shí)達(dá)到最高值,分別為7329.62u/mg(蛋白)和2191.43u/(g·min),CAT活性在脅迫濃度為15%脅迫4天時(shí)達(dá)到最高值148.347u/(g·min);MDA含量逐漸升高,在脅迫濃度為25%脅迫6天時(shí)達(dá)到最高值116.775μmol/g;采用磺基水楊酸法對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(Pro)的含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pro含量隨時(shí)間增加逐漸增加,隨濃度的增加呈先增后降趨勢(shì),在脅迫濃度為15%脅迫6天時(shí)達(dá)到最高值316.602ug/g。
【圖文】：

電泳檢測(cè)大豆種子總 of total RNA in soybean0 Marker; 1: 總 RNA; 1:，并以此為模板進(jìn)行，與預(yù)測(cè)片段大小一M 1 2000000p.2 PCR 擴(kuò)增 Gmpm13PCR amplification of Gm1、2：均為 PCR 產(chǎn)物

5002 0001 000750250100M 1bp2.1 電泳檢測(cè)大豆種子tion of total RNA in soyb000 Marker; 1: 總 RNAA，并以此為模板進(jìn)），與預(yù)測(cè)片段大小M 1 2
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S565.1;Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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9 樓靚s，

本文編號(hào)：2592742